分枝虫草子实体生长碳氮源需求及主要成分分析*

林 敏，宋 斌，黄 浩，林群英，李 挺

(广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070)

〈生理生化〉

分枝虫草子实体生长碳氮源需求及主要成分分析*

林 敏，宋 斌**，黄 浩，林群英，李 挺

(广东省微生物研究所，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东 广州 510070)

研究不同碳源和氮源对分枝虫草子实体生长的影响，并分析栽培所获得子实体的主要成分。结果显示，在本实验条件下分枝虫草子实体生长的最佳碳源、氮源分别是甘油、硝酸钾；其子实体的粗蛋白、粗纤维、粗脂肪和灰分含量分别为17.9%、13.3%、1.02%和2.5%，腺苷、多糖、虫草素和虫草酸的含量分别为1.1%、0.01%、0.005%和4.82%，含有17种氨基酸，微量元素铁、锰、铜、锌、镍和铬含量分别为16.7 mg·g-1、8.0 mg·g-1、9.6 mg·g-1、49.9 mg·g-1、1.4 mg·g-1和0.15 mg·g-1，铅、砷、汞的含量符合国家食用菌相关标准的要求。研究结果可为分枝虫草人工栽培技术研究提供有用的参考依据，并显示分枝虫草子实体具有潜在应用价值。

分枝虫草；人工栽培；子实体；碳氮源；成分分析

广义的虫草(Cordyceps)种类迄今在全世界已报道超过400种，中国已报道的虫草也超过了100种[1-3]。现代研究表明，虫草属的许多种类具有抗肿瘤、抗病原、抗氧化以及增强人体免疫功能等多种药理作用[4，5]，虫草富含腺苷、虫草素、虫草酸等活性成分和多种氨基酸、微量元素、维生素等营养成分[6]。尽管虫草资源丰富且功效显著，但被开发利用的种类还十分有限，仅有冬虫夏草(C.sinensis)、蛹虫草(C.militaris)、广东虫草(C.guangdongensis)等少数品种得到栽培应用[7]。分枝虫草(C.ramosa)主要分布在安徽(模式产地)、福建、甘肃和广东等省区，当地民间常利用其治疗妇科出血症，包括崩漏、月经过多、更年期子宫出血、产后恶露不绝和宫内节育器所致子宫出血等，是中国特有的具有药用价值的真菌[8,9]。但分枝虫草野生资源很少，尚未有人工栽培的报道。本文对分枝虫草子实体进行了不同碳氮源需求试验与主要营养成分分析，旨在为分枝虫草资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株GDIM_CR20110521由广东省微生物研究所微生物资源中心提供，4℃保存备用。

1.2 基础培养基

1.2.1 PDA培养基

马铃薯200 g、琼脂20 g、葡萄糖20 g，补水至 1 000 mL，pH值为6.5，分装于500 mL三角瓶，115℃灭菌20 min，冷却至常温备用。

1.2.2 液体培养基

葡萄糖10 g、酵母浸膏3 g、麦芽浸出物3 g、蛋白胨5 g，补水至 1 000 mL，pH为6.5，分装于500 mL三角瓶，115℃灭菌20 min，冷却至常温备用。

1.2.3 米饭培养基

大米1 kg，营养液1L～2L，其营养液由葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨8 g·L-1、磷酸二氢钾1 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、维生素B10.5 mg·L-1组成，pH 6.0～6.5，按20 g·瓶-1分装于栽培瓶，121℃灭菌40 min后冷却至常温备用。

1.3 试验方法

1.3.1 分枝虫草栽培试验

从分枝虫草斜面上挑取10块0.5 cm2的菌丝块，接种装有100 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，23℃、120 r·min-1振荡培养10 d。用无菌水按1∶3比例稀释生产菌种，取约10 mL接入米饭培养基中，25℃暗培养10 d，待菌丝长满培养基后，进行光照(10 h·d-1)培养，14 d后可长出子实体原基，再继续培养60 d，待部分子实体顶部变成白色且扁削形或圆形，即进行采收，得到分枝虫草子实体，并称鲜重。

1.3.2 不同碳源对分枝虫草子实体生长的影响

改变米饭培养基中营养液的碳源种类，分别以20 g·L-1可溶性淀粉、麦芽浸出物、糊精、蔗糖、麦芽糖、甘油替代营养液中的葡萄糖，不添加任何碳源的培养基为空白对照。方法同1.3.1。重复3次。考察不同碳源对分枝虫草子实体生长的影响。

1.3.3 不同氮源对分枝虫草子实体生长的影响

改变米饭培养基中营养液的氮源种类，分别以20 g·L-1牛肉浸膏、黄豆粉、酵母浸膏、硝酸钾、甘氨酸、奶粉替代营养液中的蛋白胨，以不含氮源的培养基作为对照。方法同1.3.1。重复3次。考察不同氮源对分枝虫草子实体生长的影响。

1.3.4 分枝虫草子实体主要营养成分测定

将分枝虫草子实体于60℃烘干至恒重，粉碎，过20目筛。粗蛋白含量参照GBT5009.5-20106.1第一法测定[10]；粗纤维含量参照GBT5009.10-2003重量法测定[11]；粗脂肪含量参照GBT5009.6-2003重量法(第二法)测定[12]；灰分含量参照GB 5009.4-2010重量法测定[13]；多糖(以葡萄糖计)、腺苷、虫草素和虫草酸均参照[14]测定；氨基酸含量参照GBT5009.124-2003进行样品测定[15]。

1.3.5 分枝虫草子实体微量元素测定

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS17.0(SPSS Inc.，Chicago, IL)软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对分枝虫草子实体生长的影响

不同碳源对分枝虫草子实体生长的影响见图1。

图1结果显示，不同碳源对分枝虫草子实体生物转化率的影响大小分别是甘油>麦芽浸出物>可溶性淀粉>葡萄糖>麦芽糖>糊精>蔗糖，方差分析表明无显著性差异(p=0.05)。在7种不同的碳源中，甘油最有利于分枝虫草子实体的生长，生物转化率为61.66%，子实体外观最好。而蔗糖最不利于子实体的生长，生物转化率仅为36.7%，明显低于空白对照组。

2.2 不同氮源对分枝虫草子实体生长的影响

不同氮源对分枝虫草子实体生长的影响见图2。

分枝虫草子实体在7种供试的氮源培养基上均能生长，方差分析表明无显著性差异(p=0.05)。但以黄豆粉为氮源时，对分枝虫草子实体的生长影响最大，生物转化率达到59.2%，其次是硝酸钾为56.99%。黄豆粉为氮源时子实体无法形成独立的棒状，颜色偏白。硝酸钾作氮源时子实体最细长，呈金黄色且形成条形。因此，确定分枝虫草子实体生长的最佳氮源为硝酸钾。

2.3 主要营养成分

2.3.1 常见营养活性成分

经测定，分枝虫草子实体的常见营养成分为粗蛋白17.9%、粗纤维13.3%、粗脂肪1.02%、灰分2.5%。分枝虫草子实体的活性成分含有多糖1.1%、虫草素0.005%、虫草酸4.82%、腺苷0.01%和虫草酸4.82%。

2.3.2 氨基酸组成与含量

分枝虫草子实体的主要17种氨基酸含量见表1。

表1 分枝虫草子实体氨基酸组成与含量

注：*表示必需氨基酸。

氨基酸总含量为12.392 mg·g-1，其中必需氨基酸总含量3.812 mg·g-1。

2.3.3 微量元素含量

分枝虫草子实体的微量元素含量情况见表2。

表2 分枝虫草子实体微量元素含量

注：-表示低于检测最低限量。

从表2可以看出，铁、锰、铜、锌、镍和铬含量分别为16.7 mg·g-1、8.0 mg·g-1、9.6 mg·g-1、49.9 mg·g-1、1.4 mg·g-1和0.15 mg·g-1，铅、砷、汞的含量符合国家食用菌相关标准的要求[25]。

3 小结与讨论

分枝虫草子实体生长的最佳碳源、氮源分别为甘油和硝酸钾。子实体的粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、灰分含量分别为17.9%、13.3%、1.02%、2.5%；腺苷、多糖、虫草素、虫草酸含量分别为1.1%、0.01%、0.005%、4.82%，其中虫草素含量与冬虫夏草的含量相近[26]，腺苷含量达到《中国药典》(2005)的要求[27]；氨基酸含量虽与广东虫草、冬虫夏草、蛹虫草、九州虫草的含量互有差异[28]，但含有17种氨基酸，种类齐全；而重金属铅、砷、汞的含量则在国家规定的食用菌安全标准范围之内[29，30]。

试验结果显示，分枝虫草是1种具有潜在商业应用价值的珍稀虫草品种，值得进一步深入研究。

[1] Sung GH, Hywel-Jones NL, Sung JM, et al. Phylogenetic classification ofCordycepsand the clavicipitaceous fungi[J]. Stud. Mycol., 2007(57): 5-59

[2] CABI. Bioscience and CBS Database of Fungal Names [EBOL]. 2014-10-10[2012-08-16].http:www.indexfungorum.org.

[3] 宋斌, 林群英, 李泰辉，等. 中国虫草属已知种类及其分布[J]. 菌物研究，2006，4(4)：10-26.

[4] 梁宗琦. 中国真菌志(第32卷，虫草属)[M]. 北京：科学出版社，2007：1-190

[5] 曾宏彬，宋斌，李泰辉. 蛹虫草研究进展及其产业化前景[J]. 食用菌学报，2011，8(2)：70-74.

[6] 傅岚，陈作红. 虫草属真菌化学成分及药理作用研究进展[J]. 生命科学研究，2004，8(1)：1-7.

[7] 李春如，南圣姬，耿德贵，等. 十七种虫草的子实体培育研究[J]. 菌物学报，25(4)：639-645，2006

[8] 邓叔群. 中国的真菌[M]. 北京：科学出版社，1964：1-808.

[9] 黄年来. 中国大型真菌原色图鉴[M]. 北京：中国农业出版社, 1998:1-293.

[13] GB5009.4-2010，食品中灰分的测定[S].

[14] 马莺，王静，牛天娇. 功能性食品活性成分测定[M]. 北京：化学工业出版社，2005：1-342.

[26] 林群英，李泰辉，宋斌，等. 广东虫草与冬虫夏草及蛹虫草的成分比较[J]. 食用菌学报，2009，16(4)：54-57

[27] 国家药典委员会. 中国药典Ⅰ部[M]. 北京：化学工业出版社，2005：75.

[28] 张海英，凌建亚，张长铠. 九州虫草与冬虫夏草、蛹虫草氨基酸成分比较[J]. 德州学院学报，2005，21(6)：31-34

[29] 中华人民共和国卫生部. 保健食品检验与评价技术规范[M]. 北京：人民卫生出版社，2003：246-310.

[30] GB7096-2003，食用菌卫生标准[S].

Study on Carbon and Nitrogen Requirements for the Fruitbody Growth and Analysis on Main Components ofCordycepsramosa

LIN Min, SONG Bin, HUANG Hao, LIN Qun-ying, LI Ting

(Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, State Key Laboratory of Applied Microbiology, Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, South China, GuangzhouGuangdong510070)

Effects of carbon sources and nitrogen sources on the fruitbody growth ofCordycepsramosawere determined, and main components of fruitbodies were analyzed. The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glycerol and KNO3respectively under the experimental condition. And the contents of crude protein, crude fiber, crude fat and ash in its fruit bodies from artificial cultivation were 17.9%, 13.3%, 1.02%, 2.5% respectively. The contents of adenosine, polysaccharide, cordycepin, cordycepic acid inCordycepsramosafruit bodies were 1.1%, 0.01%, 0.005% and 4.82% respectively. And 17 kinds of amino acids were detected from the fruit bodies. The microelement levels, such as Fe, Mn, Cu, Zn, Ni, Cr were 16.7 mg·g-1, 8.0 mg·g-1, 9.6 mg·g-1, 49.9 mg·g-1, 1.4 mg·g-1and 0.15 mg·g-1respectively. Levels of the heavy metals, such as Pb, As and Hg, met the edible fungus safety standard levels specified by the Ministry of Health of the People’s Republic of China. The results could provide useful references for further optimization of artificial cultivation ofCordycepsramosa, and indicated that fruitbodies ofCordycepsramosahad potential application value.

Cordycepsramosa; Cultivation; fruitbody; Carbon and nitrogen sources; Components analysis

*项目来源：粤科技项目“野生分枝虫草人工栽培技术研究”，项目编号：2011B020303003；粤科技成果转化项目“蛹虫草产业化技术应用与示范”，项目编号：2012NL031；穗科技项目“我国特有种分枝虫草优质高产培育关键技术研究”，项目编号：201300000031；中科院微生物研究所真菌学国家重点实验室项目“中国重要食药用菌资源多样性及保护研究”，项目编号：SKLM(2013-2015)。

林敏(1983-)，女，助理研究员，主要从事真菌资源开发利用研究。

**通信作者： 宋斌，研究员，E-mail: ganoderma@vip.163.com

2014-09-11

S646.9

A

1003-8310(2014)06-0043-03