北冬虫夏草优良菌株选育

玄永男，刘美善，崔林虎，高晔华，赵 丽

(延边林业科学院，吉林 延边 133001)

北冬虫夏草优良菌株选育

玄永男，刘美善，崔林虎，高晔华，赵 丽

(延边林业科学院，吉林 延边 133001)

本试验筛选出优良的北冬虫夏草菌株LKA，其菌丝满皿时间短，菌丝长势粗壮，子座分布均匀，生长速度快，生物学效率达到63.65%，其虫草素含量为野生冬虫夏草的613.5倍。

北冬虫夏草；栽培技术；有效成分

北冬虫夏草Cordycpsmilitaris(L.)Link,又名蛹虫草，属真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、麦角菌目、麦角菌科、虫草属的模式种，与冬虫夏草同属异种[1]。蛹虫草的化学成分和药理活性研究结果表明，其子座除了富含蛋白质、氨基酸、维生素及钙、锰、锌、硒等微量元素外，还含有虫草素、虫草酸、过氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物质。性平，味甘，具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和性功能等作用，可杀灭喉癌细胞，能补肺益肾壮阳，有扶虚损、益精气、止血、化痰、镇静、免疫等多种功效[2-5]。

目前，野生蛹虫草为国家采集收购品种，但资源极为稀少，而市场价格又甚为昂贵。北冬虫夏草菌种特性不稳定，在继代培养及栽培过程中容易发生菌种退化，出现子实体生长不整齐，产生畸形等，因此其育种工作一直是北冬虫夏草研究过程中国内外共同关注的课题。有关菌种选育方面研究，国内外相关报道较多，目前已筛选出多个虫草素含量高的高产优质菌株[6，7]。

本试验从野生北冬虫夏草中分离得到纯培养的菌种，经过初步筛选后，将获得的优良菌种进行有效成分分析，并与野生冬虫夏草进行比较，得到适合工厂化生产的北冬虫夏草菌株, 为进一步进行北冬虫夏草工厂化提供优良菌株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

在作物生长旺盛、雨量充沛的5月至11月，先后在长白山地区的安图县、和龙市、抚松县、靖宇县、通化市、白山市等不同海拔的林区内，采集野生北冬虫夏草作为试验材料。

1.2 培养基质

1.2.1 母种培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，加水至 1 000 mL，pH自然。

1.2.2 液体菌种培养基

PDB培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g，加水至 1 000 mL，pH自然。

1.2.3 栽培培养基

桑蚕蛹培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 北冬虫夏草菌种分离及初步筛选

选取生长良好，外形健壮且尚未有孢子弹射的野生北冬虫夏草子座，切取大小5 mm左右，将组织表面用清水清洗，用0.1%～0.2%升汞水消毒处理1 min～2 min，使用无菌水冲洗2次，之后接种于PDA培养基中，25℃光培养，待组织块长出菌丝无污染即为纯菌种。每个处理10次重复，从接种后第5天开始定时观察记录，根据菌丝生长速度、长势、整齐度、感染杂菌程度等指标进行菌种初步筛选，并使用数码相机拍照记录。

1.3.2 北冬虫夏草栽培试验

将经过初步筛选的菌种接种于PDB液体培养基中，静置24 h后，25℃震荡培养，获得北冬虫夏草液体菌种。将桑蚕蛹按照每瓶120 g的标准进行装瓶，高压灭菌后每瓶接入液体菌种5 mL，每个处理10次重复，比较其杂菌感染率、子座生长情况及生物学效率。

1.3.3 北冬虫夏草有效成分含量检测

将筛选出的北冬虫夏草菌株经栽培试验后，进行有效成分含量测定，并将其成分与野生冬虫夏草有效成分进行比较，具体测定方法：虫草素、虫草酸、腺苷含量测定参照中国药典第106页试验方法；虫草多糖测定采用苯酚-硫酸法；超氧化物歧化酶活性测定参照中华人民共和国国家标准GBT 5 009.171-2003。

1.3.4 数据分析

原始数据的处理、相关性分析及图表，采用 Excel 软件处理，方差分析采用 SPSS12.0软件处理，应用Duncan单因素方差分析比较各处理之间的差异显著性(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 野生资源采集

从各不同地区采集到不同寄主的野生北冬虫夏草菌株，具体生长状况如图1所示。

2.2 不同北冬虫夏草菌株菌种分离

将不同的野生北冬虫夏草菌株进行组织分离后，获得纯培养的菌种，从中选取生长状况良好的菌株进行继代培养，筛选出优良菌种。

从中将菌丝生长整齐，长势良好的菌种筛选出作为试验材料进行菌株的稳定性试验，并将其分别命名为YA、LKA、EA，其菌丝生长情况比较见表1和表2。

表1 北冬虫夏草优良菌种菌丝生长状况比较

表2 北冬虫夏草优良菌种菌丝生长速度比较

注：小写英文字母表示p<0.05水平上的差异显著性,大写英文字母表示p<0.01水平上的差异显著性。

由表1及表2可见，不同菌株菌丝生长情况存在差异，LKA菌丝为橙黄色，而其余2个菌株菌丝均为浅黄色，并且LKA菌株菌丝长势粗壮，边缘整齐，无拮抗带产生，18 d时菌丝长满培养皿，菌丝生长速度显著优于其余2个菌株。具体生长情况如图2所示。

2.3 北冬虫夏草优良菌种栽培比较

接种45 d后，各菌株子座形成情况见表3和图3。

表3 不同北冬虫夏草菌株子座形成情况比较

注：小写英文字母表示p<0.05水平上的差异显著性。

由表3、图3可见，试验菌株均有子座产生，且均为橙黄色，但其子座产生数量及品质存在差异。菌株EA有畸形子座产生，并出现子座膨大生长受限情况，子座粗细、高度不均，生长缓慢；YA菌株产生的子座粗细不均匀，相比之下，LKA子座生长速度最快，子座粗细均匀，且子座鲜重及干重均显著高于其余2个菌株，生物学效率达到63.65%。

2.4 北冬虫夏草菌株与野生冬虫夏草有效成分含量比较

北冬虫夏草与野生冬虫夏草主要活性成分比较见表4。

表4 北冬虫夏草与野生冬虫夏草主要活性成分比较

如表4所示，通过活性成分分析，试验生产的北冬虫夏草菌株LKA子座中虫草素含量为野生冬虫夏草的613.5倍，腺苷和麦角甾醇含量分别为野生北冬虫夏草的1.47倍和12.22倍，虫草酸和虫草多糖含量低于野生冬虫夏草，分别为野生冬虫夏草的0.33倍和0.54倍，且超氧化物歧化酶活性仅在北冬虫夏草中检测得到。

3 结论

本试验选育的菌株LKA菌丝满皿时间短，菌丝长势粗壮，栽培试验过程中，菌株LKA子座生长速度最快，子座粗细均匀，且子座鲜重及干重均显著高于其余2个菌株，生物学效率达到63.65%，并且其虫草素含量为野生冬虫夏草的613.5倍，达到908 mg100g，腺苷、麦角甾醇及超氧化物歧化酶活性也均高于北冬虫夏草。

[1]李昊，吴白昌，李春兰. 虫草人工栽培与深度开发[M].北京：科学技术文献出版社，2003：3-5.

[2]匡彦德，王美英，钱琴芳，等. 冬虫夏草免疫增强作用机理的研究[J].上海免疫学杂志，1989，9(1)：6-8.

[3]刘风安，郑效. 蚕蛹虫草与冬虫夏草抗癌作用对比研究[J].白求恩医科大学学报，1995，21(1)：39-40.

[4]李绍平，季晖，李萍，等. 冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展[J].中草药，2001，32(4)：373-375.

[5]徐锦堂. 中国药用真菌学[M].北京：北京医科大学，1997：394-401.

[6]Das SK, Masuda M, Hatashita M, et al. A new approach for improving cordycepin productivity in surface liquidculture ofCordycepsmilitarisusing high-energy ion beam irradiation[J].Letters in Applied Microbiology，2008(47)：534-538.

[7]康丽娜. 野生与人工栽培蛹虫草主要成分对比分析[J].新农业，2013(3)：48-49.

Selection and Breeding on Fine Strains ofCordycepsmilitaris

XUAN Yong-nan, LIU Mei-shan, CUI Lin-hu, GAO Ye-hua, ZHAO Li

(Yanbian Academy of Forestry, YanbianJilin133001)

Fine stains ofCordycepsmilitariswere selected, the time of mycelium covering the culture dish was in a short time, and the mycelium were vigorous. The stroma had a fast growth rate and well distributed, and biological efficiency reached 63.65%. The content of cordycepin was 613.5 times higher than that of wildCordycepssinensis.

Cordycepsmilitaris; Culture technology; Effective components

玄永男(1965-)，男，正高级工程师，主要从事森林生态学研究。E-mail:yblkyxyn0701@sina.com

2014-07-10

S646.9

A

1003-8310(2014)05-0017-03