OSAHS合并T2DM与血浆UⅡ及Ghrelin的相关性

王 天， 张 涛

(暨南大学附属第一医院耳鼻咽喉科，广东 广州 510630)

近年来随着对阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS)的不断研究，人们逐渐认识到OSAHS是一种具有潜在危险的疾病.随着对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病机制和治疗方法的深入研究以及近几年来睡眠医学事业的迅速发展，T2DM患者的睡眠质量问题及睡眠相关疾病逐渐走入了临床研究视野.OSAHS与T2DM之间在病理机制上是否应该存在着某种联系，还有待进一步研究证明.尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ，UⅡ)是近期发现的一种已知最强的血管活性肽，有缩血管、促进气道平滑肌细胞增殖、调节血糖代谢及脂肪合成等生物学效应.生长素释放肽(Ghrelin)是一种新的“饥饿激素”，可促进生长激素分泌，增加脂肪积聚，抑制胰岛素分泌从而刺激胰高血糖素的明显增加，由此参与T2DM的发生、发展.目前还有研究发现Ghrelin对呼吸节律、肺功能等均可产生影响，由此可推断Ghrelin很可能参与了OSAHS的发生、发展过程.

本研究拟通过检测单纯T2DM、单纯OSAHS患者、OSAHS合并T2DM患者及正常对照人群的体质量指数(body mass index，BMI)、空腹血糖(fasting blood glucoseFPG)、血氧饱和度(saturation of arterial blood oxygen，SpO2)、呼吸暂停低通气指数(apneahypopnea index，AHI)、血浆 UⅡ及 Ghrelin的值，分析这些值的组间差异及相关性，进一步了解OSAHS与T2DM的发生、发展的机理，以及探索UⅡ、Ghrelin在OSAHS和T2DM的发病机制中的作用与否.从而提高对OSAHS合并T2DM的早期诊断水平，可为新治疗方法的提出做准备.

1 对象与方法

1.1 研究对象

研究对象为2013年3月～2013年11月间我院耳鼻咽喉科及内分泌科的排除肺部病变、脑血管意外、冠心病(询问病史及血脂、胸片、心电图检查)的年龄在40～65岁见的住院病人60例，以及年龄在40～60岁间的正常对照组20人.

1.2 实验分组

试验组中单纯2型糖尿病(T2DM)患者20人为A组，其中男9例、女11例;单纯阻塞性睡眠呼吸暂停低通气(OSAHS)患者20人为C组，其中男12例、女8例;T2DM合并轻中度OSAHS患者20人为B组，其中男11例，女9例;正常对照组为D组，其中男10例，女10例.

1.3 诊断标准

T2DM患者的诊断符合WHO的T2DM诊断标准(诊断标准按WHO1999标准).经ESS嗜睡评估表初筛联合7 h的PSG睡眠监测后，OSAHS患者的诊断符合《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南》(2011年修订版)，并由呼吸暂停低通指数(apnea-hypopnea index，AHI)数值判断单纯OSAHS患者及合并T2DM的OSAHS患者皆为轻中度的OSAHS.

1.4 检测方法

(1)一般情况及血样标本采集 所有入选病例均详细询问病史，均测身高(m)、体质量(kg)、计算体质量指数(BMI).体质量指数(BMI)=体质量(kg)/身高(m2)，行心电图、X线及生化检测排除肿瘤、冠心病、肾病、肝脏疾病及脑血管疾病等.所有受试者皆填写ESS嗜睡评分(The Epworth sleeping scale，ESS)表初筛，在做多导睡眠图(polysomnogram，PSG)检查前24 h内禁止服用各类镇静药物及酒、茶、咖啡等，使用多导睡眠监测仪连续行不少于7 h的睡眠呼吸监测.监测指标包括睡眠呼吸暂停低通气指数(apnea-hypopnea index，AHI)、最低动脉血氧饱和度(low arterial oxygen saturation，LSaO2)及平均动脉血氧饱和度(mean arterial oxygen saturation，MSaO2)等.监测报告由计算机分析加人工修改的方法完成.于监测结束后第2天清晨测空腹血糖，并抽取10 mL静脉血待测.留取标本时，受试者无感染、发热及心衰，留取标本前1周未服用任何药物.血样在采血后均立即加入含有EDTA-NaZ的Lavender Vacutaner管中，轻摇几次防止血液凝固，然后将管中的血样转移到含抑蛋白酶肤(0.6 IU/mL血样)的离心管内，混匀后离心(3 000 r/min，0～4℃，10 min)，取上清-70℃冷冻待测.

(2)主要仪器、试剂及相关指标检测 1)多导睡眠记录器是由美国Sandman Elite公司提供的康迪多导睡眠监测仪，观察指标经电脑记录后，进行自动计算.2)UⅡ测定:采用酶联免疫分析法(ELISA方法)，所有标本一次性完成检测.试剂盒由上海卡迈舒公司提供，严格按照说明书要求进行，具体步骤如下:测定步骤:标准品稀释后，分别设空白孔、标准孔、待测样品孔.设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加;标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL;待测样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL;随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板).所有孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min.所有孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值.绘制标准曲线:在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值.人UⅡ抗体与大鼠、小鼠的 UⅡ交叉反应分别为18.2%和15.1%，与人内皮素-1、血管紧张素Ⅱ、降钙素基因相关肽等血管活性肽间无交叉反应，上海卡迈舒提供的试剂盒中所用试剂:①准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数 R值，大于等于0.990 0.②灵敏度:最低检测浓度小于 1.0 ng/mL.③检测范围:9.3 ～300 ng/mL.

(3)人生长激素释放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)的检测采用酶联免疫分析法(ELISA方法) 所有标本一次性完成检测.试剂盒由上海卡迈舒公司提供，严格按照说明书要求进行，具体步骤如下:设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加;标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL;待测样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL;随后标准品孔和样本孔中(空白孔不加)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50 μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60 min.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板).所有孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min.所有孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值.绘制标准曲线:在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值.上海卡迈舒公司提供的人生长激素释放肽ghrelin试剂盒中的试剂:①准确性:标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.990 0.②灵敏度:最低检测浓度小于1.0 ng/mL.

1.5 统计处理

SPSS 13.0软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间比较用单因素方差分析与q检验.相关分析采用Pearson直线相关法，以P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 各组受试对象一般临床资料比较

表1 实验组与对照组BMI、FBG、SpO2、颈围、腰围、AHI、ESS评分(±s)比较Table1 Comparision of the BMI、FBG、SpO2、Neck and Waist circumference、AHI、ESS between the experimental group and the control group

表1 实验组与对照组BMI、FBG、SpO2、颈围、腰围、AHI、ESS评分(±s)比较Table1 Comparision of the BMI、FBG、SpO2、Neck and Waist circumference、AHI、ESS between the experimental group and the control group

1)P ＜0.05 compared with OSAHS group;2)P ＜0.05 compared with T2DM group;3)P ＜0.05 compared with T2DM group

分组 n 年龄/岁 体重指数/(kg·m-2)cFBG/(mmol·L-1) SpO2/% l颈围/cm l腰围/cm AHI/(次·h-1)A 组 20 54.48 ±10.38 21.48 ±4.97 13.44 ±4.341)91.00 ±2.57 37.41 ±3.12 95.20 ±8.63 3.4 ±1.1 B 组 20 53.63 ±11.49 27.25 ±1.98 11.02 ±2.791) 73.08 ±8.032)41.21 ±4.09 104.40 ±14.60 18.6 ±11.33)C 组 20 52.68 ±12.01 25.96 ±2.22 6.09 ±0.07 76.95 ±9.742)40.60 ±3.30 104.38 ±9.25 17.3 ±12.63)D 组 20 48.13 ±9.81 23.73 ±3.43 4.21 ±0.22 94.30 ±5.6 37.30 ±3.18 92.38 ±8.51 3.1 ±1.4 F值1.362 1.2181.12 0.912 P 值 0.359 0.310 0.298 0.438

2.2 各组血清间UⅡ、Ghrelin的比较

表2 实验组与对照组UⅡ、Ghrelin比较Table2 Comparision of the serum UⅡand Ghrelin between the experimental group and the control group

2.3 各组血清间UⅡ、Ghrelin均值差多重比较

表3 各组血清UⅡ间的多重对比Table3 Multiple comparison of the serum UⅡbetween each group

表4 各组血清Ghrelin间的多重对比Table4 Multiple comparison of the serum Ghrelin between each group

2.4 轻度与中度OSAHS患者UⅡ、Ghrelin、FBG的均值比较

表5 轻度、中度OSAHS患者的比较Table5 The comparison between the mild and the moderate patients( ± s)

表5 轻度、中度OSAHS患者的比较Table5 The comparison between the mild and the moderate patients( ± s)

分 组UⅡ/(ng·mL-1)Ghrelin/(ng·mL-1)FBG(mmol·L-1)B组 B1组(5＜AHI＜15)(8人)231.74 ±26.71 34.58 ±4.21 10.41 ±3.09 B2组(15＜AHI＜30)(12人)234.69 ±24.87 37.38 ±3.97 11.53 ±2.57 C 组 C1组(5＜AHI＜15)(10人) 230.43±27.12 34.11±8.32 5.68±0.11 C2组(15＜AHI＜30)(10人)234.17 ±30.11 35.78 ±7.84 6.12 ±0.23

2.5 UⅡ、Ghrelin 与 BMI、FBG、SpO2 间的直线相关性

表6 直线相关性Table6 Linear correlation

3 讨论

近年来研究发现，OSAHS和T2DM之间有着紧密的联系［1-2］.T2DM患者中存在OSAHS的高患病率，OSAHS患者又常合并2型糖尿病，二者同时存在，互为加重因素，使心脑血管意外的发生机率大大增加.在糖尿病患者中，OSAHS的发病率是正常人的3～4倍.乔月等［3］对136例住院T2DM病人进行研究发现 OSAHS 占31.62%.West等［4］通过大量门诊患者和人群之间横向交叉研究显示，糖尿病组患者中，OSAHS的患病率可达23%.目前也已有很多研究认为，OSAHS与T2DM之间存在着独立于年龄、体质量、饮食、遗传等原因的相关性［5-7］.周燕斌等［5］通过对比研究60例OSAHS及20例正常对照组糖耐量，发现OSAHS独立于年龄、性别等混淆因素引起血糖异常及促进2型糖尿病发生.但是也有研究人员认为OSAHS与T2DM的作用与肥胖相关.Kapsimalis等［8］指出，腰臀比是胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)的决定因素，Harsch 等［9］用高胰岛素正常血糖钳夹技术记录3个月间40例OSAHS患者使用持续正压通气(continouse positive airway pressure，CPAP)治疗的数据发现，非肥胖患者比肥胖患者胰岛素敏感性改善更迅速.由此看来OSAHS与T2DM的相关性是否独立于体质量、遗传等因素而存在还有待进一步研究验证.OSAHS患者可能通过缺氧损害、睡眠片段化、胰岛素受体异常、脂代谢絮乱、炎症因子作用等途径致T2DM的发生.T2DM患者可能通过肥胖、自主神经病变、微血管病变、脑动脉硬化症等途径致OSAHS的发生.UⅡ是一重要的内源性血管活性物质，由11个氨基酸组成［10］.研究表明UⅡ是迄今为止最强的缩血管的物质，比内皮素还要强10倍［11］.UⅡ具有收缩血管、收缩气道平滑肌、促进细胞增殖及脂肪合成等生物学效应，其可能与心血管疾病的发生、发展相关［12］.近年来发现UⅡ与T2DM和OSAHS的形成均密切相关［13］.UⅡ的增高可能是2型糖尿病合并阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者疾病发生、发展的重要因素.自1999年KOJIMA［14］在 Nature杂志报道至今，ghrelin已逐渐成为国内外学者在代谢领域的研究热点.Ghrelin是调节垂体GH分泌的内源性激素，对夜间生长激素、皮质激素升高现象起主要驱动作用.Ghrelin是唯一促进食欲的外周激素，可引起体质量明显增加.

本研究通过检测单纯T2DM、单纯 OSAHS患者、OSAHS合并 T2DM患者及正常对照人群的BMI、FPG、SpO2、AHI、血浆 UⅡ及 Ghrelin 的值，分析这些值的组间差异及相关性，以求进一步了解OSAHS与T2DM的发生、发展的机理，以及探索UⅡ、Ghrelin在OSAHS和T2DM的发病机制中的作用与否.从而提高对OSAHS合并T2DM的早期诊断，为新治疗方法的提出做准备.本实验结果提示:入选的60例实验患者与20例健康对照者间的年龄、性别、BMI之间差异并无统计学意义.AHI与FBG、BMI、年龄做直线相关性分析结果提示:OSAHS严重度(由AHI值体现)与BMI、年龄之间无直线相关性.这些结果都验证了前期文献的结论:OSAHS与T2DM之间的相关性独立于年龄、体质量而存在.本实验结果显示:单纯T2DM组、单纯OSAHS组、T2DM合并轻中度OSAHS组的UⅡ、Ghrelin血浆浓度皆较正常组高，且差异有统计学意义.这提示血浆UⅡ、Ghrelin浓度在 T2DM、OSAHS患者中确有改变.本研究结果显示:T2DM合并OSAHS组的血浆UⅡ、Ghrelin浓度较单纯的T2DM及单纯的OSAHS组高，且差异有统计学意义，这就提示UⅡ、Ghrelin在T2DM、OSAHS中浓度提高有叠加效应，T2DM、OSAHS间存在着共同的通路.本实验结果显示:中度的OSAHS患者血浆UⅡ、Ghrelin浓度较轻度OSAHS患者高，且差异有统计学意义;AHI与FBG、UⅡ、Ghrelin间有着线性相关性，且随着AHI值的增加FBG值会增高，UⅡ、Ghrelin值也会随着增高.提示血浆UⅡ、Ghrelin的浓度可反应OSAHS、T2DM的严重程度及共患与否;UⅡ、Ghrelin的升高可加重OSAHS、T2DM的病情.

血浆UⅡ在T2DM领域的研究、Ghrelin在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症领域的研究都才起步不久，随着研究的深入，必将在2型糖尿病和阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合症的临床诊断、临床治疗方面提供新的思路和途径.OSAHS与T2DM密切相关，临床上对于T2DM患者，特别是血糖控制不理想及血糖波动幅度较大者，如发现患者存在OSAHS等因素应积极行OSAHS的筛查及治疗干预，要重视OSAHS与糖尿病的关系治疗，通过改善OSAHS进而改善胰岛素抵抗及血糖水平，达到协同治疗的目的.在本研究中血浆 UⅡ、Ghrelin在 OSAHS合并T2DM患者中增高较单纯OSAHS及单纯T2DM患者明显，因此猜想UⅡ与Ghrelin对OSAHS并T2DM的作用可能存在一些共同的通路，例如:①UⅡ、Ghrelin皆可抑制胰岛素作用，引起胰岛素抵抗;②OSAHS患者夜间的缺氧、低质量的睡眠皆可通过下丘脑-垂体-肾上腺素轴(HPV)的作用使血浆UⅡ、Ghrelin含量升高;③UⅡ、Ghrelin皆可致脂肪代谢的异常，从而加重OSAHS及T2DM的症状等.具体联系途径还需更多实验研究来证明.本研究做出的关于通过改变血浆UⅡ、Ghrelin的浓度可以对OSAHS及T2DM起到一定治疗效果的猜想还有待进一步实验研究的证明.

［1］ PELEDA N，KASSIRERB M，SHITRITA D.et al.The association of OSAS with insulin resistance，inflammationand metabolic syndrome［J］.Respir Med，2007，101(1):696-701.

［2］ TAMURA A，KAWANO Y，WATANABE T，et al.Relationship between the severity of obstructive sleep apnea and impaired glucose metabolism in patients with obstructive sleep apnea［J］.Respir Med，2008，102(10):1412-1416.

［3］ WESTS D，NICOLL D J，STRADLING J R.Prevalence of obstructive sleep apnoea in men with type 2 diabetes［J］.Thorax，2006，61(11):945-950.

［4］ BOTROS N，CONCATO J，MOHSENIN V，et al.Obstructive sleep apnea as a risk factor for type 2 diabetes［J］.Am J Med，2009，122(12):1122-1127.

［5］ 周燕斌，谢灿茂，肖海鹏，等.阻塞性睡眠呼吸暂停综合征对血脂及糖代谢的影响［J］.新医学，2001，32(9):530-531.

［6］ NARESH M，PUNJABI，EYAL SHAHAR，et al.Sleep disordered breathing，glucose intolerance，and insulin resistance:the sleep heart health study［J］.Am J Epidemiol，2004，160(6):521-530.

［7］ MESLIER N，GAGNADOUX F，GIRAUD P，et al.Impaired glucose in sulin metabolism in males with obstructive sleep apnea syndrome［J］.EurRespir J，2003，22(1):156-160.

［8］ KAPSIMALIS F，VAROUCHAKIS G，MANOUSAKI A，et al.Association of sleep apnea severity and obesity with insulin resistance，C-reactive protein，and leptinlevels in male patients with obstructive sleep apnea［J］.Lung，2008，186(4):209-217.

［9］ HARSCH I A，SCHAHIN S P，RADESPIEL-TROGER M，et al.Continuous positive airway pressure treatment rapidly improves insulin sensitivity in patients with obstructive sleep apnea syndrome［J］.Am J RespirCrit Care Med，2004，169(2):156-162.

［10］ BERN H A，PEARSON D，LARSON B A，et al.Neurohomones from fishtails:thecaudalneurosecretory system I“Urophysiology”and the caudal necrosecretory system of fishes［J］.Recent ProgHorm RES，1985，41(1):533-552.

［11］ STROHL K P，NAVAK R D，CAHANC，et al.Insulinlevels，blood pressure and sleep apnea［J］.Sleep，1994，17(7):614-618.

［12］ CONLON J M，YANOK，WAUGHD，et al.Disstribution an dmolecular forms of urotensinⅡand its role in cardiovascular regulation invertebrates［J］.Expor，1996，275(2-3):226-238.

［13］ TOTSUNEK，TAKAHASHIK，ARIHARA Z，et al.Increased plasma urotensinⅡlevels in patients with diabetes mellitus［J］.Clin Sci，2003，104(1):1-5.

［14］ KOJIMAM，HOSODA H，DATE Y.Ghrelin is a growthhor-mone-releasing acylated peptide from stomach［J］.Nature，1999，402(2):656-660.