康复1号对小鼠成骨细胞增殖的影响

赵德春吴绍长邢葆平李晓一

1浙江省武义县妇幼保健院 武义 322300 2浙江省丽水市第二人民医院 3浙江省立同德医院

康复1号对小鼠成骨细胞增殖的影响

赵德春1吴绍长2邢葆平3李晓一3

1浙江省武义县妇幼保健院 武义 322300 2浙江省丽水市第二人民医院 3浙江省立同德医院

目的观察康复1号提取物对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖的影响。方法将稀释成不同梯度浓度的康复1号提取物和成骨样细胞MC3T3-E1共同体外培养，采用MTT法检测细胞的增殖。结果康复1号提取物低浓度组（1:2000）对MC3T3-E1细胞增殖无影响（P＞0.05）；中浓度组（1:1000）对细胞增殖影响明显，增殖率48.1%（P＜0.05）；高浓度组（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。结论体外实验表明，康复1号能明显促进小鼠MC3T3-E1细胞的增殖。

小鼠；骨质疏松症；MC3T3-E1细胞；康复1号

骨质疏松是由多种原因引起的一种全身性骨骼疾病。目前我国骨质疏松患者8400万人，占总人口的6.6%[1]。成骨细胞是骨质形成过程中的重要细胞，在预防骨质疏松中起重要作用。康复1号是本院的协定处方，由煅龙骨、煅牡蛎、熟地黄、淮山药、茯苓、淫羊藿、骨碎补等中药组成。多年临床应用显示，康复1号对骨质疏松有较好的疗效。本研究以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为细胞模型，通过体外实验的方法，观察康复1号提取液对成骨细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1材 料 中药材由浙江中医药大学饮片厂提供；5.3-（4，5）-二甲基-2-噻唑-（2，5）-苯基溴化四氮唑盐（MTT）粉剂购于美国Sigma公司；0.25胰酶消化液和细胞培养基（DMEM培养基）购于美国GIBCO公司；PAA胎牛血清购于上海微科生物有限公司。细胞株及细胞培养MC3T3-E1细胞由浙江大学传染病研究所提供。

1.2方 法

1.2.1药物制备 各味药材按处方剂量（煅龙骨、煅牡蛎各24g，熟地黄、淮山药、茯苓各9g，淫羊藿12g，骨碎补9g等）配伍后捣碎过20目筛，取100g加水回流提取3次（1h/次），浓缩配成相当于生药材大约1g/mL的储备液，经0.45um微膜过滤、除菌，置4℃保存备用。实验时用无血清DMEM依次按梯度稀释成终浓度为1:250、1:1000、1:2000。

1.2.2实验方法 以Mosmann建立的MTT比色法[2]，检测细胞增殖。将成骨样细胞MC3T3-E1接种于培养瓶中，置于5%CO2分压、饱和湿度、37℃的细胞培养箱中进行培养传代。待传代至第3代时，取其生长旺盛的MC3T3-E1成骨样细胞，将成骨样细胞加入到4%胎牛血清成骨样细胞培养基中，配制成浓度为5×104个/mL的悬液，再接种于成骨样细胞培养板，贴壁生长24h后加入不同梯度浓度的康复1号提取物，每个浓度4个复孔。于37℃，5%二氧化碳培养箱48h后，每孔加入30μL MTT溶液（2mg/mL），继续培养4h，吸净上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡5～15min，使MTT还原产物结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪测定每孔光密度殖（A值），波长定于570nm。测得等体积的细胞孔的吸光值为对照，将不同浓度的加药组与对照组进行比较，细胞增殖率计算公式：增殖率=（实验组-对照组）/对照组× 100%

1.3统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料用（） 表示，采用单因素方差分析，各组间增殖率比较采用卡方检验。

2 结果

康复1号提取物和MC3T3-E1细胞共孵育48h后，低浓度组（1:2000）对细胞增殖无影响（P＞0.05）；中浓度组（1:1000）对细胞增殖影响明显，增殖率48.1%（P＜0.05）；高浓度组（1:250）增殖率68.1%（P＜0.01）。随着药物浓度的增加，对MC3T3-E1细胞增殖的影响也明显加大，各剂量组两两比较，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。见表1、图1。

表1 康复1号提取物对MC3T3-E1细胞增殖的影响（）

表1 康复1号提取物对MC3T3-E1细胞增殖的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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图1 各浓度康复1号提取物共孵育后MC3T3-E1细胞生长图

3 讨论

骨质疏松症是以骨质量丢失以及骨组织退变为特征的骨代谢疾病，成骨细胞在骨重建过程中具有重要作用[2]。MC3T3-E1细胞株是日本学者KODAMA等在1981年从新生C57BL/6小鼠颅盖骨中分离培养建株的成骨细胞株。该细胞株具有体外培养成骨细胞的各种生物学特性，包括碱性磷酸酶（ALP）活性、I型胶原合成和基质钙化等成骨细胞的生物学特性，常作为骨代谢研究的细胞模型[4]。

中医认为，肾主骨、生髓藏精，为先天之本，肾精的盛衰对骨骼的生长代谢有密切关系。肾精足则骨髓之生化有源，骨髓充，骨骼得到髓的充分滋养则骨骼坚。肾精亏，骨髓生化不足，髓腔空虚而不能营养骨骼，肾虚精髓不充，骨失所养为其主要病机。根据“肾主骨”理论，应用仙茅配伍加减补肾阳，强筋骨，对骨质疏松症有较好的治疗效果，其中淫羊藿具有增强骨形成和降低骨吸收的双重作用。骨碎补总黄酮能明显提高去卵巢大鼠骨密度，同时具有调整血清IL-4、IL-6、TNF-α水平的作用，IL-6、TNF-α等细胞因子能够促进破骨细胞（OC）的骨吸收。骨碎补提取物还能抑制OC性骨吸收[5-6]。

本实验结果表明，康复1号能明显促进MC3T3-E1成骨细胞增殖，在不同的药物浓度的作用下对成骨细胞的增殖有明显变化及影响。可增强成骨细胞活性,加速成骨细胞的增殖与分化，使骨量增加，从而明显促进骨修复和骨形成，这可能是康复1号治疗骨质疏松症的部分机制。

［1］詹前进.骨质疏松的诊断与治疗之进展［J］.医疗保健器具，2001，（2）：183-188.

［2］Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays［J］.J ImmunolMethods，1983，65（1-2）：55-63.

［3］孟繁浩，熊志立，陶胜宇，等.成骨细胞的生物学特征及其调控活性物质［J］.化学与生物工程，2005，（11）：8-10.

［4］Kodama H，Amagai Y，Sudo S，et al.Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria［J］. Jpn J Oral Biol，1981，23（4）：899-901.

［5］姜向冲，刘敏如.补肾复方胶囊含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响［J］.成都中医药大学学报，2009，（01）：46-50.

［6］于海涛，鞠成国，章琦，等.狗脊生、制品不同提取部位对成骨细胞的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（24）：36-39.

Effect of Herb Rehabilitation No.1 on Mouse Osteoblast Proliferation

ZHAO Dechun1,WU Shaochang2,XING Baoping3,LI Xiaoyi. 1 Zhejiang wuyi maternity care,Wuyi (322300),China;2 The Second People's Hospital of Lishui City;3 Tongde Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo observe the effect of rehabilitation No.1 herb extracts on the proliferation of MC3T3-E1 cells.MethodsOsteoblast-like MC3T3-E1 cells were cultured in vitro with different concentrations of herb extracts of rehabilitation No.1.Cell proliferation was detected by using MTT method.ResultsLow concentration group（1:2000）of the rehabilitation No.1 herb extract had no effect on the proliferation of MC3T3-E1 cells;the proliferation rate was 48.1%in middle concentration group（1:1000）（P＜0.05）;and the proliferation rate of high concentration group（1:250）was 68.1%（P＜0.01）.ConclusionRrehabilitation No.1 herb extracts can promote the proliferation of MC3T3-E1 cells in vitro.

mice；osteoporosis；MC3T3-E1 cells；rehabilitation No.1 herb extracts

2013-09-24

修回日期：2013-10-20

浙江省中医药科学研究基金项目（No.2012ZB004）；浙江省医药卫生平台重点资助计划（No.2012ZDA007）；浙江省医学卫生科学研究基金项目（No.2010KYB133）

李晓一，E-mail：2001life@163.com