桑叶总黄酮对糖尿病高脂血症大鼠血糖、血脂和胸主动脉p22phox mRNA表达的影响

张凇铭黄 平杜静静

1浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310053 2浙江省中医院

·论 著·

桑叶总黄酮对糖尿病高脂血症大鼠血糖、血脂和胸主动脉p22phox mRNA表达的影响

张凇铭1黄 平2杜静静1

1浙江中医药大学第一临床医学院 杭州 310053 2浙江省中医院

目的探讨桑叶总黄酮（FML）对糖尿病高脂血症大鼠血糖、血脂和胸主动脉p22phox mRNA表达的影响。方法60只雄性SD大鼠随机分成空白组、模型组、FML低、中、高剂量组和西药组，每组10只，观察FML对大鼠血糖、血脂、胸主动脉p22phox mRNA表达的影响。结果与空白组比较，模型组大鼠血糖、血脂显著升高（P＜0.01），胸主动脉p22phox mRNA表达明显上调（P＜0.01）。与模型组比较，FML中、高剂量组及西药组大鼠血糖、血脂降低（P＜0.05或P＜0.01），FML中、高剂量组及西药组大鼠胸主动脉p22phox mRNA表达明显下调（P＜0.05或P＜0.01）。结论FML显著降低糖尿病高脂血症大鼠血糖、血脂水平，其机制可能与FML下调大鼠胸主动脉p22phox mRNA表达，进而抑制NADPH氧化酶活化有关。

大鼠；糖尿病；高脂血症；桑叶总黄酮；p22phox mRNA；血糖；血脂

有研究表明，糖尿病无论大血管还是微血管的并发症都有同一种发病机制—即高糖损伤后产生的氧化应激[1]。氧化应激扰乱了组织的正常功能。NADPH氧化酶活化是生成氧自由基的关键[2]，p22phox是导致NADPH酶活化的关键亚基[3]。也有研究表明，富含黄酮类化合物的植物提取物具有降低血脂、清除体内自由基等功效[4]。本研究旨在通过动物实验探讨桑叶总黄酮（total flavonoid of mulberry leaf，FML）抑制大鼠胸主动脉p22phox mRNA表达作用，同时观察FML对血糖、血脂等指标的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1动 物 雄性SD大鼠60只，体质量（170±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证：SCXK（沪）2008-0016，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养于浙江中医药大学动物房。

1.2药物与试剂 桑叶总黄酮（FML）（纯度：50.5%；规格：1kg/包，塑封；批号ZL121016；南京泽朗医药科技有限公司）；链脲佐菌素（STZ）（纯度：99.89%；规格：500mg/瓶；批号B64927，北京博爱港商贸中心）；mRNA提取试剂（规格：50T；批号C周0584，世纪康为生物公司）；RT-PCR试剂盒（规格：2500T/50ul反应体系，批号372300101，北京鼎国生物有限公司）；高糖高脂饲料（5%蛋黄粉、10%猪油、20%白糖、2%胆固醇、0.2%胆酸钠、62.8%基础饲料，浙江省医学科学院）。

2 实验方法

2.1造模与分组 60只雄性SD大鼠依次编号为1～60号，应用随机数字表法进行完全随机分组，随后选取10只大鼠，作为空白组，予普通饲料喂养直到试验结束，其余50只大鼠按倪红霞[5]高糖高脂饮食加STZ一次性腹腔注射法复制糖尿病高脂血症大鼠模型，50只大鼠予高糖高脂饮食饲养4周，4周后所有大鼠禁食12h，空白组大鼠按30mg/kg腹腔注射pH4.4的柠檬酸缓冲液，其余50只大鼠一次性腹腔注射STZ（1%STZ 30mg/kg，现配），3天后所有大鼠测血糖及24h尿量，以血糖＞16.7mmol/L，尿量大于空白组50%者为造模成功，成模后的大鼠依旧按随机数字表法再次完全随机分为5组，即模型组、FML低剂量组（0.4g/3mL，FML）、FML中剂量组（0.8g/3mL，FML）、FML高剂量组（1.6g/3mL，FML）、罗格列酮与辛伐他汀联合组（以下简称西药组，0.2mg罗格列酮+ 0.8mg辛伐他西/3mL），每组各10只，采用固定时间灌胃给药方式进行，空白组及模型组予灌胃等体积的生理盐水，1天1次，持续给药4周，治疗期间模型组及治疗组继续给予高糖高脂饲料喂养，直到试验结束。

2.2标本收集 给药4周后处死全部大鼠，以10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒铺巾，打开胸腔，心脏取血，抗凝管保存，剥离胸主动脉，放入液氮罐中，随后转入-80℃冰箱保存待用。

2.3观察指标及方法

2.3.1血糖测定 采用强生血糖试纸及血糖仪，所有大鼠分别于造模前、给药2周后及给药4周后尾静脉断尾取血测血糖。

2.3.2血脂指标测定 取全血1～2mL，放入抗凝管中妥善保存，委托浙江中医药大学动物实验中心实验室测定CH、TG、LDL-C。

2.3.3胸主动脉p22phox mRNA表达 采用RTPCR法。严格按照动物组织总mRNA提取试剂盒说明书操作方法操作，提取SD大鼠胸主动脉总RNA。0.5mLEp管中加入3μg总RNA，Oligo（dT）18引物1uL，dNTPs 1μL，5×First-strand 4μL，M-MLV 1uL，RNA酶抑制剂1μL，用RNase水补足至20μL，离心后，42℃保温60min，95℃5min，4℃2min，冰上骤冷后得到cDNA。引物根据Gene Bank序列用Primer5.0软件设计后由北京鼎国昌盛生物公司合成。p22phox的正向引物：5’-ACT CCC ATT GAG CCT AAA CC-3’;反向引物5’-GGA GCA ACA CCT TGG AAA C-3’;产物片段226bp。内参GADPH正向引物：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’；反向引物：5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’；产物片段452bp。PCR总体系10uL，其组成为cDNA 3μL，HS Taq 5μL，引物正反向各0.2μL，ddH2O 1.6μL。反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，72℃延伸10min。

2.3.4统计学方法 应用SPSS18.0软件，数据以（） 表示，计量资料进行方差分析，组间均数两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠血糖比较 给药2周和4周后FML低剂量组与模型组比较，虽有差异但无统计学意义（P＞0.05）；FML中、高剂量组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；西药组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 各组给药2周和4周血糖值比较（） mmol/L

表1 各组给药2周和4周血糖值比较（） mmol/L

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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3.2各组大鼠血脂比较 模型组与空白组各指标比较，差异有统计学意义（P＜0.01），说明造模成功。FML中、高剂量组和西药组大鼠总胆固醇和甘油三酯降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。FML低、中、高剂量组和西药组LDL-C降低与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表2。

表2 各组血清CH、TG和LDL-C比较（） mmol/L

表2 各组血清CH、TG和LDL-C比较（） mmol/L

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

3.3FML对SD大鼠胸主动脉p22phox mRNA表达的影响 模型组胸主动脉p22phox mRNA表达量较空白组明显上调（P＜0.01）。FML低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；FML中、高剂量组和西药组与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 各组p22phox mRNA表达量比较（） ng/mL

表3 各组p22phox mRNA表达量比较（） ng/mL

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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4 讨论

糖尿病是心血管疾病发病的重要危险因素之一，高糖情况下内皮细胞发生特异的功能改变导致血管脂质斑块形成是血管并发症的主要表现。研究[6]表明，高糖有细胞毒性，降低细胞自由基清除功能，加速细胞凋亡。内皮细胞发生功能改变的主要原因有：①氧化应激增强，体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多；②内皮细胞凋亡；③诱发炎症反应。抑制细胞内氧化应激是保护内皮细胞功能、防治糖尿病心血管并发症的关键途径之一[7]。

ROS在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用，低水平的ROS可以促进内皮细胞生长，而高水平的ROS则可诱导内皮细胞凋亡。ROS的产生途径有NOS失偶联、NADPH氧化酶活化等，其中NADPH氧化酶活化是公认的内皮系统中最主要的ROS来源。NOX主要包括五个组分：p22phox、p47phox、Rac1、p67phox、p91phox[8]。p22phox是NADPH氧化酶活性必需亚单位。P22phox在72位和94位的组氨酸残基是血红蛋白的结合位点，与NOX的功能密切相关。Christ等[9]用高浓度葡萄糖处理过的猪冠状动脉，分离出的细胞中能观察到p22phox mRNA表达上调，Talija等[10]提高内皮细胞p22phox mRNA表达后发现细胞内ROS显著增加。这些研究提示p22phox参与血管内皮细胞ROS的生成，增加氧化应激反应。

桑叶异名铁扇子，首载于《神农本草经》，桑叶性味甘、寒，甘所以益血，寒所以凉血，甘寒相合，故下气而益阴，有补益之功，是中医清热解毒之要药。1963年Sharat等首次报道桑叶水提液的降血糖作用，也有研究表明，富含黄酮类化合物的植物提取物具有降低血脂、降低ROS水平等功效。桑叶含丰富的黄酮类化合物，为纯天然药物，毒副作用小，适合糖尿病患者长期服用。

本研究结果发现经FML治疗后大鼠胸主动脉p22phox mRNA相对表达量下调，大鼠血糖、血脂指标降低，提示FML有抑制p22phox mRNA表达，降血糖、血脂的功效。其机制可能是：一方面FML下调p22phox mRNA表达，减少NADPH氧化酶活化，抑制氧化应激反应，保护血管内皮细胞；另一方面降低体内高糖环境，降低细胞毒性，减缓细胞凋亡。既往的动物实验表明，FML具有降血脂作用，但并没有说明其降血脂的机制。本实验结果表明，FML可以通过抑制氧化应激关键活化酶必需亚单位p22phox mRNA表达，达到保护内皮细胞降低血脂防治糖尿病心血管并发症，其作用大小与FML浓度有关。由于本实验样本小，观察时间短，尚存在一定不足，至于是否还有NADPH氧化酶亚单位参与ROS形成，FML是否还作用于NADPH氧化酶的其他亚单位，FML是否能具有预防炎症反应，其降糖又是通过哪些途径发生作用，有待进一步研究。

［1］Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54（6）：1615-1625.

［2］De Champlain J，Wu R，Girouard H，et al.Oxidative stress in hypertension［J］.Clinical and experimental hypertension，2004，26（7-8）：593-601.

［3］Sagar S，Kallo IJ，Kaul N，et al.Oxygen free radicals in es-sential hypertension［J］.Molecular and Cellular Biochemistry，1992，111（1-2）：103-108.

［4］Rueckschloss U，Quinn MT，Holtz J，et al.Dose-dependent regulation of NAD（P）H oxidase expression by angiotensin II in human endothelial cells：protective effect of angiotensin II type 1 receptor blockade in patients with coronary artery disease［J］.Arteriosclerosis,thrombosis,and vascular biology，2002，22（11）：1845-1851.

［5］倪红霞.高糖高脂饮食诱导的大鼠Ⅱ型糖尿病模型［J］.北华大学学报（自然科学版），2006，7（5）：440-442.

［6］Irani K.Oxidant signaling in vascular cell growth，death，and survival：a review of the roles of reactive oxygen species in smooth muscle and endothelial cell mitogenic and apoptotic signaling［J］.Circ Res，2000，87（3）：179-183.

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［9］Christ M，Bauresachs J，Liebetrau C，et al.Glucose increases endothelial-dependent superoxide formation in coronary arteries by NAD（P）H oxidase activation:attenuation by the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor atorvastatin［J］.Diabetes，2002，51（8）：2648-2652.

［10］Matsushita H，Lee KH，and Tsao PS.Cyclic strain induces reactive oxygen species peoduction via an endothelial NAD（P）H oxidase［J］.J Cell Biochem，2001，（Suppl 36）：99-106.

Effects of Total Flavonoids from Mulberry Leaves on Blood Glucose,Blood Lipid and the expression of P22phox mRNA in Thoracic Aorta in Diabetic and Hyperlipidemia Rats

ZHANG Songming1,HUANG Ping2, Du Jingjing1.1 The First Clinical Medical College of Zhejiang University of Chinese Medicine,Hangzhou(310053), China;2 Zhejiang Provincial Hospital of TCM

ObjectiveTo investigate the influence of total flavonoids from mulberry leaves（FML）on blood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta in rats with diabetes and hyperlipidemia.MethodsDiabetes and hyperlipidemia rats were used in this study.Sixty SD male rats were randomly into blank group,model group,treatment groups（high,middle,low dose of FML and western medicine group）,10 in each group.The effect of FML on blood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta was observed.ResultsBlood glucose,blood lipid and the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta in rats in model group were higher than those in blank group（P＜0.01）.Compared with model group,rats in middle and high dose of FML groups and western medicine group had lower blood glucose,blood lipid and decreased expression of p22phox mRNA in thoracic aorta（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionFML can inhibit levels of blood glucose and blood lipids in diabetes and hyperlipidemia rats.This effect may be due to decreasing the expression of p22phox mRNA in thoracic aorta and then the activation of NADPH oxidase.

rats；diabetes；hyperlipidemia；flavonoids from mulberry leaves；p22phox mRNA；blood glucose；blood lipids

2013-08-27

浙江省科技厅、省团委、教育厅基金资助项目（No.2012R410059）

黄平，Tel：18958025557；E-mail：htyhp_63@163.com