肝癌与肝炎患者肝内人纤维介素的表达及意义

蒙梦兰 玉艳红 黄力毅 吴继周

作者单位：530021 南宁 广西医科大学第一附属医院感染性疾病科

临床研究

肝癌与肝炎患者肝内人纤维介素的表达及意义

蒙梦兰 玉艳红 黄力毅 吴继周

作者单位：530021 南宁 广西医科大学第一附属医院感染性疾病科

目的 探讨轻度、中度、重度慢性乙型肝炎及肝癌患者肝组织内人纤维介素（又称人纤维蛋白原样2凝血酶原酶，human fibrinogen-like protein 2 prothrombnase，hFgl 2）的表达及其与患者血清转氨酶（ALT、AST）、胆红素（TBIL）、血浆凝血酶原时间（PT）等指标的相关性，并分析其意义。方法 对14例轻度慢性乙型肝炎、13例中度慢性乙型肝炎、8例重度慢性乙型肝炎及22例肝癌患者，应用免疫组化方法分别检测其肝炎组织及肝癌组织内hFgl 2的表达，使用MIAS医学图像分析软件测定hFgl 2的表达水平。结果 hFgl 2在重度慢性乙型肝炎组及肝癌组的表达均高于轻度及中度慢性乙型肝炎组（P均＜0.05）。慢性乙型肝炎组患者肝组织内hFgl 2蛋白的表达水平与患者血清ALT、AST的水平呈正相关（P＜0.001），在肝癌组中hFgl 2的表达水平与患者PT、ALT、AST、TBIL均无相关性（P均＞0.05）。结论 肝癌和重度慢性乙型肝炎患者肝内人纤维介素呈高表达，在慢性乙型肝炎中其水平与肝细胞破坏严重程度相关，而在肝癌中则无相关性，提示人纤维介素在肝癌中的作用可能不同于慢性乙型肝炎。

肝肿瘤；人纤维介素；慢性乙型肝炎；肝组织；表达

人纤维介素又称人纤维蛋白原样2凝血酶原酶（human fibrinogen-like protein 2 prothrombinase，hFgl 2），是一种新发现的凝血因子，能够直接激活凝血酶原，启动凝血反应［1］。有研究显示hFgl 2在多种肿瘤如结肠癌、子宫颈癌、乳腺癌等癌组织内［2］以及肝炎患者外周血单核细胞中高表达，且其在肝炎外周血液单核细胞中的表达水平与肝炎的严重程度相关［3～5］，提示hFgl 2可能参与肿瘤的发生、发展及肝炎的活动。本研究旨在通过研究肝癌和不同严重程度慢性乙型肝炎患者肝组织内hFgl 2蛋白的表达及其与转氨酶等多项外周血液生化指标的相关性，以探讨肝组织内hFgl 2蛋白的表达在肝癌及慢性乙型肝炎中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

采集2009～2011年在广西医科大学第一附属医院感染性疾病科、肝胆外科和南宁市第四人民医院共57例住院患者的信息，其中慢性乙型肝炎患者35例，肝癌患者22例。将研究对象分为A组：轻度慢性乙型肝炎组14例；B组：中度慢性乙型肝炎组13例；C组：重度慢性乙型肝炎组8例；D组：肝癌组22例。慢性乙型肝炎的诊断及分度符合我国2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》［6］。肝癌诊断符合2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准。收集患者住院期间总胆红素（TBIL）、转氨酶（ALT、AST）、凝血酶原时间（PT）等生化检测结果及相应患者的肝组织或肝癌组织标本，使用免疫组化方法检测肝组织内hFgl 2的表达，用MIAS医学图像分析软件检测hFgl 2的表达水平。

1.2 试剂

玉抗：鼠单克隆抗体（美国SANTA CRUZ公司）。Ⅱ抗：MaxVision鼠/兔-HRT即用型广谱快捷免疫组化试剂盒（KIT-5020，福州迈新生物技术有限公司）。3-3二氨基联苯胺（DAB-0031）、PBS磷酸盐缓冲液、EDTA抗原修复液购自福州迈新生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肝组织的免疫组化制片 将肝组织制成石蜡切片，切片脱蜡后用EDTA（pH=9.0）抗原修复液进行高压抗原修复，自来水冲洗后置于30g/L过氧化氢溶液室温孵育以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗后滴加稀释的玉抗（浓度为1∶200的鼠单克隆抗体），室温孵育1.5 h或置于冰箱冷藏室内4℃过夜。PBS冲洗后加入50 μl生物素标记的Ⅱ抗，室温孵育20～30 min。PBS冲洗除去多余二抗后进行DAB显色，酒精脱水，封片。

1.3.2 MIAS医学图像分析 以同一张切片内hFgl 2凝血酶原酶表达阴性细胞为内对照，观察各组织免疫组化切片内hFgl 2凝血酶原酶阳性的细胞种类及强度。采集hFgl 2凝血酶原酶阳性表达的肝组织细胞图像，随机选取8～10个区域，使用MIAS医学图像分析软件测定其灰度值，取平均值为测定结果。灰度值与hFgl 2蛋白的表达水平呈负相关，即灰度值越低，hFgl 2蛋白的表达水平越高。

1.4 统计学方法

用SPSS 16.0统计学软件处理实验数据并分析。计量资料以均数±标准差（χ±s）表示。均数的比较采用拓展方差分析（Welch检验），两两比较采用Tamhan′s T2检验，双变量相关分析采用Spearman秩相关，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组患者肝组织内hFgl 2蛋白的表达情况

在所有慢性乙型肝炎患者肝组织和肝癌患者肝癌组织中均可见hFgl 2蛋白的表达。见图1。

图1 各组患者肝组织内hFg1 2蛋白的免疫组化染色（×1 000）

2.2 各组患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及肝内hFgl 2蛋白表达平均灰度值的比较

各组患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2的灰度值经方差齐性检验提示方差不齐（P＜0.05），故使用拓展方差分析（Welch检验）行多组间均数比较，两两比较方法采用Tamhan′s T2检验。结果显示重度慢性乙型肝炎组和肝癌组hFgl 2表达的平均灰度值低于轻度、中度慢性乙型肝炎组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2蛋白表达灰度值的比较（s）

表1 各组患者PT、TBIL、ALT、AST的水平及hFgl 2蛋白表达灰度值的比较（s）

☆与D组比较，P＜0.001；★分别与A组、B组、D组比较，P=0.003、0.012、0.004；△分别与D组比较，P=0.012、0.013。*分别与A组、B组比较，P=0.013、0.046；**分别与A组、B组比较，P=0.006、0.017。

项目 A组 B组 C组 D组 F′ P PT（s） 11.0±0.75☆11.7±1.23 11.6±1.12 13.4±2.00 6.331 0.003 TBIL（μmol/L） 13.6±5.7 28.30±23.8 76.7±30.0★17.5±8.3 12.357 ＜0.001 ALT（U/L） 32.7±13.3△106.0±108.0 222.7±204.3 140.±143.5 7.662 0.002 AST（U/L） 26.07±5.6△65.4±49.2 197.8±243.8 95.9±131.5 7.519 0.002 hFgl 2 182.0±1.31 181.8±2.64 178.7±2.08*177.0±6.05**8.82 ＜0.001

2.3 肝组织内hFgl 2表达的灰度值与患者PT、ALT、AST、TBIL及患者年龄的关系

慢性乙型肝炎组（A组、B组、C组3组合并）hFgl 2蛋白表达的灰度值与患者ALT、AST的水平呈负相关（与ALT的相关系数rs=-0.561，P＜0.001；与AST的相关系数rs=-0.549，P=0.001），与患者年龄、PT、TBIL的水平无相关。肝癌组hFgl 2蛋白的表达与患者年龄、PT、ALT、AST、TBIL的水平均无相关性（P均＞0.05）。

3 讨论

本研究发现，重度慢性乙型肝炎组hFgl 2表达的平均灰度值低于轻度、中度慢性乙型肝炎组，慢性乙型肝炎组hFgl 2蛋白表达的灰度值与ALT、AST呈负相关，因其灰度值与hFgl 2蛋白的表达呈负向关系，表明重度慢性乙型肝炎患者肝组织内hFgl 2的水平比轻度、中度慢性乙型肝炎患者高，且肝组织内hFgl 2水平与转氨酶水平呈正相关，说明hFgl 2的表达水平越高，肝炎程度越严重，肝细胞破坏程度越严重，提示hFgl 2可能在慢性乙型肝炎中发挥着加重肝损伤的作用。朱帆等［7］在重型肝炎患者肝组织内发现hFgl 2的表达，且其水平与血清胆红素呈正相关。陈悦等［8］在重型乙型肝炎肝组织内hFgl 2高表达细胞邻近组织发现有纤维蛋白的沉积和微血栓的形成。hFgl 2是一种凝血因子，可直接激活凝血酶原，启动凝血反应［1］，陈悦等的研究结果说明hFgl 2可能是通过促凝血机制导致肝细胞破坏。本研究结果说明肝内hFgl 2的表达水平越高，肝脏炎症越严重，结合之前学者的研究，考虑hFgl 2肝损害机制可能是乙型肝炎病毒上调hFgl 2在肝内的表达水平［9］，进而激活凝血反应，导致局部微循环障碍，在病毒直接破坏和免疫损伤的基础上，进一步加重肝细胞的损伤。不同于朱帆的研究，本研究hFgl 2的表达水平与转氨酶水平呈正相关，而与胆红素水平无相关性，考虑朱帆等研究病例为重型肝炎，肝细胞破坏殆尽，此时胆红素水平才能真正反映肝炎严重程度，而在本研究中肝炎程度较轻，转氨酶水平能较好反映肝细胞破坏的严重程度。

本研究还发现在肝癌组织内hFgl 2呈高表达，其水平比慢性乙型肝炎轻度、中度组高，但不同于慢性乙型肝炎，肝癌组织内hFgl 2的表达水平与血清转氨酶等肝功能指标无相关性，提示hFgl 2在肝癌中的作用可能与在慢性乙型肝炎中的作用不同。刘艳玲等［10］研究发现在体外hFgl 2蛋白可直接促进HCCLM 6肿瘤细胞的生长，且下调hFgl 2的表达能减缓裸鼠体内HCCLM 6细胞的生长和新生血管形成［11］。hFgl 2在结肠癌、子宫颈癌、乳腺癌等多种肿瘤中高表达，且在高表达的细胞附近可见明显的纤维蛋白沉积［2］，而已有研究显示凝血酶能直接作用于肿瘤细胞，激活肿瘤细胞，促进新生血管的形成和肿瘤生长、转移［12］，提示hFgl 2可能通过促凝血反应，增加凝血酶的产生，进而激活肿瘤细胞，促进肿瘤的生长。本研究结果发现肝癌组织内存在hFgl 2的高表达，但不同于慢性乙型肝炎，在肝癌中hFgl 2的水平与血清转氨酶等无相关，推测hFgl 2在肝癌中的作用与其在其他肿瘤中的作用类似，可能是通过促进凝血酶原转变为凝血酶，进而激活肿瘤细胞，促进肿瘤的生长，而不是通过引起微循环障碍导致肝细胞破坏。肝癌患者转氨酶、胆红素的升高可能是由于肿瘤生长浸润正常肝组织所致，故转氨酶、胆红素的高低可能与hFgl 2无相关，而与肿瘤大小、浸润程度有关。但因本研究病例数较少，今后可增加病例数及检测癌周正常肝组织hFgl 2的表达以进一步明确。

此外，本研究发现，肝内hFgl 2的表达水平与PT无关，提示hFgl 2的促凝机制可能只在局部发生作用，而对血液凝血功能无影响或者影响甚微，目前尚缺乏相关研究。此外，凝血功能与其他诸多因素有关，而肝脏能合成多种凝血因子，故肝脏功能与凝血功能密切相关。肝脏功能受损时，肝脏凝血因子合成减少，凝血功能障碍，PT延长，故PT是评估肝炎严重程度的重要指标。本研究提示轻度慢性乙型肝炎的PT较肝癌组低，考虑所纳入病例为肝穿刺活检患者，这些患者一般均为凝血功能正常者，故PT水平不能代表总体慢性乙型肝炎患者的PT水平，且肝癌患者因肝功能受损，凝血因子合成可能会减少，故这些患者不一定如其他恶性肿瘤，呈现高凝状态，而出现PT延长［13］。有关方面有待进一步研究。

［2］ 陈芳，宁琴，孙汉英，等.恶性肿瘤组织中人纤维介素的表达及作用［J］.华中科技大学学报(医学版），2006，35（4）：444-448.

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［2014-10-10收稿］［2014-11-23修回］［编辑 阮萃才］

Hepatic expression of human fibroleukin in patients with liver cancer or hepatitis

MENG Meng-lan，YU Yan-hong，HUANG Li-yi，WU Ji-zhou（Department of Infectious Diseases，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

YU Yan-hong.E-mail：yuyanhong666@163.com

Objective To explore the expression of human fibroleukin（hFgl 2），also known as human fibrinogen-like protein 2 prothrombinase，in the livers of patients with liver cancer or chronic hepatitis B virus（HBV）infection，and to examine possible correlations of this expression with severity of HBV infection and serum biochemistry indicators.Methods Liver tissues were obtained from 35 patients with chronic HBV infection（14 mild，13 moderate，8 severe）and 21 patients with liver cancer.Expression of hFgl 2 was detected using immunohistochemistry，quantified using MIAS medical imaging software and compared among patients with liver cancer or the three severities of viral infection.Results Expression of hFgl 2 was significantly higher in patients with severe chronic HBV infection or liver cancer than in patients with mild or moderate infection.Among chronically infected patients，hFgl 2 expression positively correlated with serum ALT and AST；among patients with liver cancer，hFgl 2 did not correlate with serum ALT，AST，TBIL or PT.Conclusion The protein hFgl 2 is up-regulated in severe chronic HBV infection and in liver cancer.However，the expression level correlated with serum aminotransferase in chronically HBV-infected patients，but not in patients with liver cancer.This suggests that hFgl 2 may play different roles in liver cancer and chronic HBV infection.

Liver neoplasm；Human fibroleukin；Chronic hepatitis B virus infection；Liver tissue；Expression

R735.8

A

1674-5671（2014）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.04.12

广西科学基金资助项目（桂科青0832038）

玉艳红。E-mail：yuyanhong666@163.com