半枝莲对AFB1致肝细胞凋亡及脂质过氧化损伤的保护作用

张晶晶 邵超 陆小军 叶奕菁

摘要：

目的：探讨半枝莲对AFB1致体外肝细胞毒性的保护作用及其机制。方法：通过采用四甲基偶氮唑（MTT）比色法检测AFB1对人肝癌细胞株Huh7.5细胞的生长抑制率，再用MTT法观察半枝莲作用下AFB1诱导的Huh7.5细胞增殖功能的影响，然后检测细胞内丙二醛含量（ MDA） 、红细胞超氧化物歧化酶（ SOD）的水平以观察半枝莲对AFB1引起的Huh7.5细胞凋亡及脂质过氧化损伤的保护作用。结果：AFB1能显著抑制Huh7.5细胞增殖，IC50为15μg/ mL；而半枝莲能显著抑制AFB1暴露细胞的凋亡（P < 0.01）。半枝莲能明显降低AFB1作用下肝细胞内MDA 含量， 提高其SOD活性， 与对照组比较差异有显著性（P <0.01）。结论：半枝莲对AFB1致Huh7.5细胞损伤具有保护作用，其机制与抑制肝细胞凋亡及对抗脂质过氧化有关。

关键词：半枝莲； 黄曲霉毒素（AFB1）；Huh7.5细胞；抗氧化作用

Inhibitory effect of Scutellariae barbata extract on hepatocytes apoptosis and lipid peroxidation induced by aflatoxin B1

Affiliated Zhongshan Hospital of Sun Yat-Sen University，Zhongshan， Guangdong 528403

【Abstract】

Objective：To study the mechanisms by which the Scutellariae barbata extract inhibit AFB1-induced toxicity in human hepatocytes. Methods：The MTT assay was performed to test the inhibitory rate of cell growth induced by AFB1. Then the cell survival effects of Scutellariae barbata extract were measured by using MTT on cells exposed to AFB1. Finally， the concentration of the product of lipid peroxidation malondialdehyde（ MDA） and the activity of superoxide dismutase（ SOD） were measured in Huh7.5 cells. Results：AFB1 exhibited significant cytotoxicity to Huh7.5 cells in dose- and time- dependent manners. Treatment with Scutellariae barbata extract could effectively inhibited the apoptosis of the cell， decrease the concentration of MDA and improve the activity of SOD. Conclution：The extracts of Scutellariae barbata protect HepG2 cells from the cytotoxicity of AFB1 which may relate to the possible underlying mechanisms of anti-apoptosis and antioxidation.

【Key words】Scutellariae barbata； AFB1； Huh7.5 cells； antioxidation

【中圖分类号】

R114 【文献标识码】B 【文章编号】1002-3763（2014）05-0002-02

半枝莲，为唇形科植物半枝莲的全草，又名韩信草，分布于我国南方各省区。半枝莲提取物含有生物碱、黄酮类甙、甾体以及酚类、鞣质等。其所含的半枝莲素，系一种黄酮类化合物（2，5-二羟基-6，7，8-三甲氧基黄酮），此外，还有另两种黄酮类化合物汉黄苓素（5，7-二羟基-8甲氧基黄酮）和5-羟基-7， 8-二甲氧基黄酮^[1]。体内实验表明，半枝莲的醇提物对于小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌H22细胞抑制其肿瘤增殖活性作用显著，并且对脾细胞增殖有促进作用^[2]。体外研究也证实半枝莲可抑制肝癌细胞增殖，并诱导凋亡^[3-5]。但对黄曲霉毒素B1（AFB1）诱导的细胞毒性的保护作用尚未见报到。AFB1是粮食中最常见的真菌毒素，被公认为与HCC发生密切相关的重要因素之一。研究表明AFB1对肝等主要脏器损伤的原因之一与其造成机体自由基代谢发生变化有密切的关系。自由基与许多疾病的发生和发展联系密切，主要机制是通过生物膜中的多价不饱和脂肪酸的过氧化反应，导致脂质过氧化物增多，引起细胞损伤，致使细胞代谢功能障碍，并最终引起器官功能发生改变^[6]。本试验旨在研究体外肝细胞加入AFB1后，对细胞增殖功能及抗氧化指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的影响，以及半枝莲对AFB1中毒的拮抗效应，为半枝莲在临床上防治黄曲霉毒素B1中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料、药品及试剂：

Huh7.5细胞株，由本院肿瘤实验室保存。半枝莲半购自广州市药材公司；AFB1、DMSO、HEPES及MTT为Sigma公司产品；DMEM 培养基为GIBCO公司产品；SOD、MDA试剂盒购于南京建成工程研究所。

1.2 半枝莲的醇取：

半枝莲粉碎、过筛，10倍量石油醚回流提取2次，80%乙醇回流提取3次，每次1.5h。回收溶剂至成浓水液。25 g提取物，通過萃取分离。先过滤，留滤渣。使用时用l x PBS稀释至所需的药物浓度。

1.3 细胞培养及处理：

人Huh7.5细胞株常规培养于DMEM培养基（含10%灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素，PH7.2），置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中孵育，0.1%胰蛋白酶消化传代。实验选用对数生长期细胞。AFB1被溶解在DMSO中，配成1mg/mL的母液。将处于对数生长期的Huh7.5细胞用0.5%的胰蛋白酶消化，用含胎牛血清的培养基制成5 x 104细胞/mL的悬液，以每孔100μL 接种于96孔细胞培养板中，在37℃、5% CO2条件下培养24h。

1.4 AFB1和半枝莲对Huh7.5细胞增殖的影响：

AFB1组：取Huh7.5细胞（100μL），分别加入含5、10、20、30、40、50μg/mL AFB1的DMEM的培养基，培养24h后用MTT法测570 nm 波长处吸光度（A）值，计算AFB1的细胞增殖抑制率（fa）和中效浓度（IC50）。AFB1+半枝莲组：取Huh7.5细胞（100μL），细胞贴壁后加入不同浓度半枝莲20ul，使其终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/ml（原药材浓度），2h后加入15ug/ml （IC50）每个浓度设3个平行孔、同时设置空白对照组、溶剂对照组和调零孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h。应用MTT实验检测出半枝莲对AFB1暴露的Huh7.5细胞存活70%以上的实验浓度被用于后续实验。Huh7.5细胞接种于细胞培养板（6孔板，1×106细胞/ 1mL/孔），每组设3个复孔，置于培养箱中培养24h后细胞被处理如下：（1）Con组：空白对照组；（2）AFB1组：15μg/m L AFB1 （IC50 ）； （3） AFB1+半枝莲组：15μg/m L AFB1 and 0.125mg/m L半枝莲。然后细胞被继续培养24h、48h及72h分别用MTT法检测不同时间点各组细胞的存活率。

1.5 MDA的检测：

按照“1.3”项下的6孔板分板，作用不同时间（24h、48h及72h）各组细胞被收集，加1 mL PBS制成单细胞悬液，计数，然后在冰上应用超声破碎机予200V， 30S， 间隔5S，3次破碎细胞。按试剂盒说明书加样，以硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA，同时设定空白管、标准空白管及标准管，以532nm单波长检测MDA吸光度。细胞内MDA的含量以nM/106细胞表示。

1.6 细胞内SOD的检测：

按照“1.3”项下的6孔板分板，作用不同时间（24h、48h及72h）各组细胞被收集，PBS漂洗3次，1%TritonX-100 （ PH7.4）裂解液裂解细胞lh，然后离心取上清作为SOD活性测定样品液，按照试剂盒说明书操作步骤进行，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。细胞内SOD的含量以U/106细胞表示。

1.7 统计方法：

试验结果采用SPSS 13.0 统计软件分析，各组间的显著性差异用单因素方差分析进行检验。结果以平均值±标准差表示，P < 0.05 为显著性差异。

2 结果

2.1 AFB1对Huh7.5细胞增殖的影响：

MTT法检测不同浓度的AFB1作用于人肝癌Huh7.5细胞24h后，对细胞增殖的抑制作用（表1，图1）。结果表明，AFB1能明显抑制Huh7.5细胞的增殖，并有剂量效应关系。其吸光值A（X±s）与对照组A值相比均有显著差异（P <0.01），IC50为15μg/m L。

2.2 半枝莲对AFB1暴露的细胞存活率的影响：

以MTT比色法观察到半枝莲对AFB1处理的细胞存活达到60%以上的浓度为0.125mg/mL。以0.125mg/mL半枝莲预处理后，在24h、48h和72h均提高了AFB1（15μg/m L）暴露细胞的存活率，分别提高了23%、52%及49%（P <0.01），（图2）。

2.3 半枝莲降低MDA含量：

MDA是被公认的脂质过氧化损伤的标志物。在24h、48h和72h，MDA含量在AFB1组显著高于空白对照组（P <0.01）；而半枝莲在3个时间点都明显抑制了AFB1诱导的MDA的形成（P <0.01），并有时间效应关系（表2）。

3 讨论

AFB1通过刺激磷脂A2 引起脂质过氧化反应而破坏细胞膜的完整性，继而AFB1诱导形成活性氧簇（ROS），ROS主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢等可致DNA键断裂，并与细胞的重要成分起反应，亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化链式反应[6，7]。双链脂肪酸过氧化作用可导致MDA生成增加，抗氧化物消耗增加，清除自由基能力下降，就会加重肝损伤；而且氧化应激所产生的ROS及脂质过氧化反应在化学致癌中亦发挥重要作用。超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在于各类生物体中， 能催化生物体内超氧自由基（O2- ） 发生歧化反应， 是机体内O2- 的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。因此， 机体内SOD 在防御O2- 的毒性、抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用。

人肝癌细胞株，Huh7.5细胞具有相对正常肝细胞的表型。以Huh7.5为细胞模型，本研究显示AFB1处理后Huh7.5细胞生存率明显下降，与空白对照组比较差异有统计学意义；而给予半枝莲预处理后，Huh7.5细胞的生存率显著提高，说明一定剂量的半枝莲对AFB1损伤后的Huh7.5细胞具有保护作用。

氧化损伤是AFB1的细胞毒性及致癌性的潜在机制之一，本研究显示AFB1处理Huh7.5细胞后，细胞内的MDA显著的增加，这与Hazra^[7]報道一致。这些结果进一步表明AFB1诱导了Huh7.5细胞的氧化应激反应。然而，我们的实验结果也表明半枝莲预处理明显增加了AFB1暴露细胞的活力并有效阻滞了AFB1诱导的MDA的形成，这表明半枝莲明显抑制了AFB1诱导的细胞毒性。

在正常生理条件下，有机体的抗氧化系统能够有效的清除氧化应激所导致的氧化损伤；一旦这种平衡被打破就会导致一系列的氧化损伤，进而产生病理性的改变。有机体的抗氧化防御系统一般有四个方面的功能：①抑制ROS的产生；②清除ROS；③清除、恢复或重建损伤的部分；④诱导抗氧化物酶的产生^[8]。半枝莲是标准化的制剂，是黄酮类的化合物。研究表明黄酮类是过氧化物及羟自由基的清除剂，并能有效的抑制脂质过氧化反应^[9]。我们的实验没有限定半枝莲的单体成分，因为半枝莲的活性可能是归功于它特殊的组份，或者是它的两种或更多种组份同时在起作用。黄酮类主要的化学结构包括芳香环和双键能够与ROS发生反应，可以直接清除自由基；而且黄酮类具有羟基石炭酸的结构可以和Fe2+螯合，间接抑制自由基的形成。我们的结果与Yao^[10]报道相符。

总之，我们的实验表明AFB1诱导了Huh7.5的氧化应激反应。抗氧化物半枝莲预处理有效阻滞了AFB1诱导的Huh7.5的毒性，其机制部分可能与降低细胞内MDA的水平，提高SOD活性有关，其保护作用机制有待进一步研究。

参考文献

[1]王文蜀，周亚伟，叶蕴华，等，半枝莲中黄体酮类化学成分研究[J].中国中药杂志，2004，29（10）：957-9.

[2] 代志军，刘小旭，汤薇，等，半枝莲提取物对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响及其抑瘤作用[J].南方医科大学学报，2008，28（10）：1835-7.

[3] 12. Dai ZJ，et al. Scutellaria barbate extract induces apoptosis of hepatoma H22 cells via the mitochondrial pathway involving capase-3[J]. World J Gastroenterol. 2008， 14（48）：7321-8.

[4] 韦鹏涯，等. 半枝莲提取物诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其对凋亡蛋白表达的影响[J]. 时珍国医国药，2007，18（2）：3020-2.

[5] Chui CH， et al. Activities of fresh juice of Scutellaria barbate and water extract of Radix Sophorae Tonkinensis on anti-proliferation and apoptosis of human cell lines[J].Int J Mol Med. 2005， 16（2）， 337-41.

[6] Groopman JD and Kensler TW. Role of metabolism and viruses in aflatoxin-induced liver cancer[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2005，206（2）：131–137.

[7] Hazra TK， Hill JW， Izumi T， et al. Multiple DNA glycosylases for repair of 8-oxoguanine and their potential in vivo functions[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol， 2001， 68：193-205.

[8] Noguchi N， Watanabe A， Shi H. Diverse functions of antioxidants[J]. Free Radic Res，2000， 33（6）：809–817.

[9] El-Khatib AS， Moustafa AM， Abdel-Aziz AA， et al. Ginkgo biloba extract （EGb 761） modulates bleomycin-induced acute lung injury in rats[J]. Tumori，2001，87（6）：417-422.

[10] Yao P， Li K， Song F， et al. Heme oxygenase-1 upregulated by Ginkgo biloba extract： Potential protection against ethanol-induced oxidative liver damage[J]. Food Chem Toxicol， 2007，45（8）：1333-1342.