胰岛素样生长因子结合蛋白5在胃癌中的表达及临床意义*

2014-06-28罗辉燕冯继红罗治彬

中国肿瘤临床 2014年16期

罗辉燕王玮冯继红罗治彬

罗辉燕①②王玮②冯继红③罗治彬①

目的：探讨胰岛素样生长因子结合蛋白5（insulin-iike growth factor binding protein5，IGFBP5）在胃腺癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组织化学检测236例胃腺癌手术切除术后标本中IGFBP5的表达，并探讨其表达与患者临床病理参数的相关性及对于胃腺癌的预后意义。结果：免疫组织化学结果显示，236例患者中159例（67.4%）IGFBP5表达下调，且在肿瘤大小＞5 cm、低分化胃腺癌、T3+T4a/b及Ⅲ/Ⅳ期胃癌患者中表达下调明显（P＜0.05）。生存分析显示IGFBP5低表达患者预后较差（P＜0.05）。多因素分析显示IGFBP5可作为一个独立预后风险因素（HR=1.897，P=0.029）。结论：胃腺癌中IGFBP5的表达下调，与进展期的临床病理参数相关，且提示预后不良。

IGFBP5 胃腺癌多因素分析预后

胃癌是全世界最常见肿瘤之一。研究显示仅2008年新发胃癌病例989 600例，死亡病例738 000例，分别占所有肿瘤发生率的8%和肿瘤相关死亡率的10%［1］。在我国胃癌发病率居恶性肿瘤发病率的第2位［2］。尽管目前外科手术、肿瘤化疗以及放疗的不断完善发展，胃癌患者预后仍不理想。因此寻找新的、特异性的、更有效的治疗手段是目前研究的重点。肿瘤作为一个多基因、多步骤突变的疾病，其中癌基因的激活、抑癌基因的失活、生长因子及其受体的调控、不完善的DNA修复系统，都可能在胃癌的发生、发展过程中均扮演重要的角色［3-4］。

胰岛素样生长因子结合蛋白5（insulin-like growth factor binding protein 5，IGFBP5）作为胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）家族中的重要成员，可高度与胰岛素样生长因子结合，在细胞的生长、分化、凋亡、死亡及组织重建中发挥重要作用［5］，可作为一个重要生物指标预测肿瘤患者的治疗反应和临床预后［6］。目前关于IGFBP5的表达水平和功能在不同肿瘤类型中的研究表明IGFBP5可能参与了肿瘤的促进或肿瘤的抑制［7-8］。然而，IGFBP5在人胃癌中的表达情况及其预后作用鲜见报道。因此，本研究旨在探讨IGFBP5在人胃腺癌中的表达情况并探索其与胃腺癌患者预后之间可能存在的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

石蜡包埋组织取自于2003年3月至2006年4月在中山大学肿瘤防治中心首次接受手术治疗的胃腺癌患者，共236例患者。每例组织蜡块4 μm连续切片。所有的病例均经病理证实，按照WHO分级标准进行分级。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学分析染色步骤 1）切片准备：常规脱蜡至水后，EDTA（1 mM；pH为8.0）抗原修复；2）3%过氧化氢去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶；3）加入IGFBP5（1：500）羊多克隆抗体，4℃孵育过夜；4）PBS冲洗5 min×5次，滴加试剂1，湿盒中37℃孵育20 min；5）PBS冲洗后，滴加试剂2，湿盒中37℃孵育20 min；6）PBS冲洗，DAB显色，光镜下控制显色，显色完全后用蒸馏水终止反应；7）苏木素复染10 min，水洗终止反应，分化液分化，兰化液兰化5 min；8）酒精梯度脱水依次脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察结果。

1.2.2 结果判定结果判断采用双盲法阅片。凡细胞质中出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。评分方法：将染色强度评分（无为0分；弱为1分；中为2分；强为3分）和阳性细胞率评分（＜5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；＞50%为3分）之乘积为该切片评分值。按照评分标准将IGFBP5表达分为低表达（评分≤3分）组及高表达（评分＞3分）组。

1.3 统计学分析

用SPSS 18.0统计软件包进行分析。肿瘤组织中IGFBP5表达与临床病理学参数的相关性用Pearson相关检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，两组间比较采用Log-rank。生存期的多因素分析采用多因素分析的Cox回归模型。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测IGFBP5的表达

采用免疫组织化学的方法，检测IGFBP5在236例胃腺癌中的表达。结果发现，IGFBP5在159例（67.4%）胃腺癌肿瘤组织的细胞质中表达显著下调。IGFBP5阳性反应物质为棕黄色颗粒，阳性表达的细胞主要分布在癌旁正常组织及部分胃腺癌组织的细胞质中。其中62例高/中分化的胃腺癌组织中，31例组织中IGFBP5呈低表达状态（31/62），表达下调率为50.0%；而在174例低分化腺癌组织中，128例组织IGFBP5呈低表达状态（128/174），表达下调率为73.6%。IGFBP5阳性信号主要分布于胞浆，大部分呈弥漫性全浆分布。相比较胃腺癌组织的表达下调，癌旁的正常组织通常为高表达，阴性对照均无显色（图1）。

图1 免疫组织化学法检测胃癌及癌旁非肿瘤组织中IGFBP5蛋白的表达（×200）Figure 1 Immunohistochemical detection of the IGFBP5 protein expression in gastric cancer and surrounding non-tumor tissues（IHC×200）

2.2 IGFBP5表达与胃腺癌临床病理参数之间的关系

胃腺癌组织中IGFBP5表达与肿瘤的病理分级、T分期及临床分期相关：低分化腺癌中IGFBP5表达下调率较高，而中、高分化腺癌下调较少，差异有统计学意义（P=0.032）；IGFBP5随T分期级别升高表达下调率亦逐渐升高，差异具有统计学意义（P=0.016）；另外，IGFBP5随TNM分期级别升高表达下调率亦逐渐升高，差异具有统计学意义（P=0.021）；而IGFBP5表达缺失与肿瘤大小、N分期、M分期无关（表1）。

2.3 IGFBP5表达与预后的关系

为了解IGFBP5基因的表达在胃腺癌患者预后中的作用，应用SPSS统计软件的Kaplan-Meier法进行单因素分析，Log-rank检验差异检验，进一步分析IGFBP5表达情况与胃腺癌患者生存时间的关系。经Kaplan-Meier法分析后，IGFBP5低表达组（n=159）的胃癌患者术后累计生存率低于IGFBP5高表达组（n=77），Log-rank t检验，差异显著具有统计学意义（P＜0.001，图2）。

表1 IGFBP5表达和胃腺癌患者临床病理参数之间的关系Table 1 Relationship between IGFBP5 expression and clinicopathologic features of GAC patients

表2 236例胃腺癌患者临床病理因素单因素生存分析Table 2 Univariate survival analysis of clinicopathologic variables in 236 GAC cases

图2 236例手术切除后胃腺癌患者Kaplan-Meier生存曲线Figure 2 Kaplan-Meier survival curves of gastric adenocarcinoma patients after surgical resection

2.4 单因素及多因素分析

将性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、病理类型、IGFBP5表达、TNM分期（第7版）、化疗等临床病理因素进行单因素分析。结果表明：性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、病理类型、IGFBP5表达、TNM分期（第7版）、化疗均为影响本组胃癌患者预后的因素（表2）。

将上述单因素分析显示能影响生存的因素及生存时间建立Cox比例回归模型行多因素分析。结果显示，肿瘤大小、病理类型、IGFBP5表达、TNM分期（第7版）仍为影响患者术后生存情况的独立预后因素（表3）。

表2 236例胃腺癌患者临床病理因素单因素生存分析（续表2）Table 2 Univariate survival analysis of clinicopathologic variables in 236 GAC cases

表3 236例胃腺癌患者预后变量的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of prognostic variables for survival in 236 GAC cases

3 讨论

在全球男性及女性人群中，胃癌的发病率分别列于第4及第5大常见恶性肿瘤，而在最常见的癌症死因中，胃癌在男性及女性人群中分别位居第3及第5位。胃癌作为一个地域分布特征明显的肿瘤，2/3的新发病例或死亡病例主要集中在欠发达国家［9］。胃癌作为我国最常见的肿瘤之一，虽在肿瘤的早期诊断和治疗上取得一定的进步，但是胃癌的预后总体上不理想。肿瘤作为一个多基因多步骤的疾病，其发生发展的本质依赖于肿瘤细胞的无限制复制及生长，包括（但不仅限于）生长因子及其受体、细胞外基质蛋白、蛋白酶、炎症趋化因子、细胞黏附分子等，而这些因子的表达受肿瘤微环境、遗传及环境等的影响。目前，关于IGFBP5与肿瘤发生发展依旧存在争议。IGFBP5一方面可促进肿瘤发展，Liang等［10］发现在尿路上皮癌中IGFBP5的过表达是患者不良预后的一个指标，而另一方面可作为肿瘤抑制蛋白。Luther等［11］在人骨肉瘤中的研究发现，IGFBP5可以抑制皮下成瘤和肿瘤转移。这可能与不同的肿瘤类型和肿瘤微环境相关［10-15］。

本研究对236例胃腺癌患者术后病理蜡块，通过免疫组织化学分析检测了IGFBP5在这236例中的表达。免疫组织化学结果显示IGFBP5在67.4%的胃腺癌组织胞浆中的表达下降。进一步的统计分析研究结果提示：胃癌中IGFBP5的表达与肿瘤的病理分级、T分期以及临床分期相关。在低分化腺癌、T4a/b、及Ⅲ/Ⅳ期患者中IGFBP5的表达明显降低。这些研究结果提示IGFBP5在胃腺癌中亦可能作为抑癌基因存在。

Kaplan-Meier生存分析显示，IGFBP5低表达组的术后总体生存率明显低于IGFBP5高表达组。即IGFBP5低表达患者生存情况明显较高表达患者差，进一步提示IGFBP5可能在胃腺癌中发挥着抑癌基因的作用。多因素分析亦发现IGFBP5表达情况可作为胃腺癌患者的独立预后风险因素（HR=1.897）。这些研究结果提示IGFBP5低表达情况或可作为胃癌患者新型的预后风险指标。

Sureshbabu等［16］的研究发现IGFBP5可以抑制人乳腺癌细胞的迁移，提示IGFBP5可以降低肿瘤转移的发生。Simon等［17］在胃肠道间质瘤的研究中发现钙依赖的氯化物通道DOG1可以调节肿瘤微环境中抗血管生成因子IGFBP5。这些研究提示IGFBP5在肿瘤微环境中发挥着抗肿瘤作用，而潜在作用机制复杂，需要进一步研究。

综上所述，IGFBP5与胃腺癌的发生发展有密切关系，并可在一定程度上预测胃腺癌患者的预后及淋巴结转移情况，为胃腺癌患者预后的准确评估以及个体化治疗提供帮助。

1 Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2)：69-90.

2 Zhang SW,Lei ZL,Li GL,et al.China tumor registry of cancer incidence in 2006 in area and death data analysis[J].Chinese J of Oncology,2010,19(6)：356-365.[张思维,雷正龙,李光琳,等.中国肿瘤登记地区2006年肿瘤发病和死亡资料分析[J].中国肿瘤,2010,19 (6)：356-365].

3 Sanz-Ortega J,Steinberg SM,Moro E,et al.Comparative study of tumor angiogenesis and immunohistochemistry for p53,c-ErbB2, c-myc and EGFr as prognostic factors in gastric cancer[J].Histol Histopathol,2000,15(2)：455-462.

4 Tanigawa N,Amaya H,Matsumura M,et al.Correlation between expression of vascular endothelial growth factor and tumor vascularity,and patient outcome in human gastric carcinoma[J].J Clin Oncol,1997,15(2)：826-832.

5 Firth SM,Baxter RC.Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins[J].Endocr Rev,2002,23(6)：824-854.

6 Ahn BY,Elwi AN,Lee B,et al.Genetic screen identifies insulin-like growth factor binding protein 5 as a modulator of tamoxifen resistance in breast cancer[J].Cancer Res,2010,70(8)：3013-3019.

7 Santosh V,Arivazhagan A,Sreekanthreddy P,et al.Grade-specific expression of insulin-like growth factor-binding proteins-2,-3, and-5 in astrocytomas：IGFBP-3 emerges as a strong predictor of survival in patients with newly diagnosed glioblastoma[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2010,19(6)：1399-1408.

8 Li X,Cao X,Li X,et al.Expression level of insulin-like growth factor binding protein 5 mRNA is a prognostic factor for breast cancer[J].Cancer Sci,2007,98(10)：1592-1596.

9 Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics,2009[J].CA Cancer J Clin,2009,59(4)：225-249.

10 Liang PI,Wang YH,Wu TF,et al.GFBP-5 overexpression as a poor prognostic factor in patients with urothelial carcinomas of upper urinary tracts and urinary bladder[J].J Clin Pathol,2013,66(7)：573-582.

11 Luther GA,Lamplot J,Chen X,et al.IGFBP5 domains exert distinct inhibitory effects on the tumorigenicity and metastasis of human osteosarcoma[J].Cancer Lett,2013,336(1)：222-230.

12 Güllü G,Karabulut S,Akkiprik M.Functional roles and clinical values of insulin-like growth factor-binding protein-5 in different types of cancers[J].Chin J Cancer,2012,31(6)：266-280.

13 Tombolan L,Orso F,Guzzardo V,et al.High IGFBP2 Expression Correlates with Tumor Severity in Pediatric Rhabdomyosarcoma [J].Am J Pathol.,2011,179(5)：2611-2624.

14 Kühnl A,Kaiser M,Neumann M,et al.High expression of IGFBP2 is associated with chemoresistance in adult acute myeloid leukemia[J]. Leukemia Research,2011,35(12)：1585-1590.

15 Rho SB,Dong SM,Kang S,et al.Insulin-like growth factor-binding protein-5(IGFBP-5)acts as a tumor suppressor by inhibiting angiogenesis[J].Carcinogenesis,2008,29(11)：2106-2111.

16 Sureshbabu A,Okajima H,Yamanaka D,et al.IGFBP5 induces cell adhesion,increases cell survival and inhibits cell migration in MCF-7 human breast cancer cells[J].J Cell Sci.2012,125(Pt 7)：1693-1705.

17 Simon S,Grabellus F,Ferrera L,et al.DOG1 regulates growth and IGFBP5 in gastrointestinal stromal tumors[J].Cancer Res,2013,73 (12)：3661-3670.

（2014-02-21收稿）

（2014-04-08修回）

（本文编辑：贾树明）

Expression and clinical significance of insulin-like growth factor binding protein 5 in gastric adenocarcinoma

Huiyan LUO1,2,Wei WANG2,Jihong FENG3,Zhibin LUO1
1Department of Oncology,Chongqing No.3 People's Hospital,Chongqing 400014;2Department of Stomach and Pancreas,San Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060;3Department of Tumor,The Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China

Objective:To investigate the expression and prognostic significance of insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5)in gastric adenocarcinoma(GAC).Methods:IGFBP5 expression in tissue samples from 236 GAC patients was analyzed using immunohistochemical methods.These patients had undergone surgical resection between 20003 and 2006 in Sun Yat-Sen University Cancer Center.The relationship between IGFBP5 expression and clinicopathological factors in the 236 GAC patients was analyzed using Pearson correlation analysis.The significance of IGFBP5 in predicting the survival status of these patients was analyzed using Kaplan-Meier survival analysis and Cox's proportional hazards regression model.Results:Immunohistochemical staining data indicated that IGFBP5 expression was significantly decreased in 159 of the total GAC cases(67.4%).Of the 62 cases with well-and moderately differentiated GAC,31(50%)exhibited reduced IGFBP5 expression.Of the 174 cases with poorly differentiated GAC,128 showed reduced IGFBP5 expression.Reduced IGFBP5 expression was also observed in female patients and in patients with tumors over 5 cm in size or with poorly differentiated tumors(P＜0.05).The reduced expression of IGFBP5 was common in the tumors that were staged as T3+4a/b andⅢ/Ⅳ(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis revealed that the reduced expression of IGFBP5 was associated with poor prognosis in GAC patients(P＜0.001).Cox regression analysis identified IGFBP5 expression as an independent prognostic factor for the overall survival of these cancer patients(HR=1.897,P=0.029).Conclusion:IGFBP5 expression is reduced in GAC tissues,and IGFBP5 independently predicts an unfavorable prognosis in GAC patients.

IGFBP5,gastric adenocarcinoma,multivariate analysis,prognosis