睡眠剥夺对大鼠咬肌组织形态学的影响*

王培欢 吴高义 朱国雄

咀嚼肌是下颌运动的动力，口颌系统的各种功能运动都有赖于各咀嚼肌之间的相互配合和彼此协调。在颞下颌关节紊乱病的发生发展过程中，咀嚼肌结构和功能的改变起着至关重要的作用。咬肌是颌面部最强有力的一对咀嚼肌，可使口颌系统全面受力，因此口颌系统功能的变化常首先累及到咬肌，其功能的降低将直接影响咀嚼能力。本课题组前期研究证实睡眠剥夺可引起大鼠咬肌炎症指标[1]和氧化应激指标[2]的变化，而睡眠剥夺是否同时引起大鼠咬肌组织形态学的改变，进而影响其正常功能的发挥，是我们亟待解决的一个问题。本研究旨在通过睡眠剥夺的动物模型，观察睡眠剥夺对咬肌组织形态学的影响，进一步探讨睡眠剥夺在颞下颌关节紊乱病发生发展中的作用。

1. 材料与方法

1.1 实验动物与分组 35 只成年雌性Wistar大鼠，体重200±10g，清洁级，经检查所选大鼠身体状况良好、无牙齿缺失等口颌系统疾病及全身性疾病，动物及饲料均由山东大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂和仪器 10%水合氯醛(30ml，济南军区总医院药剂科，济南)；4%多聚甲醛(AR-0211，北京鼎国昌盛生物技术有限公司，北京)；实验动物称量用电子秤(DST671，苏州市苏杭科技器材有限公司，苏州)；组织脱水机(TS-12U，孝感宏业医用仪器有限公司，孝感)；组织包埋机(BM-IX，孝感宏业医用仪器有限公司，孝感)；温控捞片机(CS-VI，孝感宏业医用仪器有限公司，孝感)；石蜡切片机(RM2235，德国莱卡仪器股份有限公司，德国)；正置显微镜成像系统(BX-43，日本奥林巴斯公司，日本)。

1.3 动物分组和处理 将35 只大鼠随机分为睡眠剥夺1d 组、5d 组、9d 组、正常对照组和大平台对照组共5 组[3]。实验组各组按相应时间点麻醉后取材，正常对照组和大平台对照组与睡眠剥夺9d 组一同麻醉取材。

1.4 动物模型的建立 采用改良多平台睡眠剥夺法[4-6]建立大鼠睡眠剥夺模型。制作110cm×70cm×40cm 的玻璃睡眠剥夺箱，箱内分别设置15 个直径6.3cm、高8cm 的平台，各平台之间间距为15cm。平台周边注满水，水面低于平台约1cm，水温保持在20℃左右。大鼠在平台上可自由进食饮水，并可在平台间自由活动，若进入睡眠状态则由于肌张力降低而落入水中，惊醒后自动爬上平台。大平台对照组平台直径为18cm，其余条件同小平台组。正常对照组单笼饲养。实验期间保持正常的昼夜光照，每日更换箱中的水。各组饲养条件相同。

1.5 咬肌标本的制作及染色观察 各组大鼠在相应时间点以10%水合氯醛(10ml / kg)腹腔注射麻醉后仰位固定于小动物实验台，消毒后切开大鼠面颊部皮肤，将咬肌组织完整取出，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，常规脱水，石蜡包埋后连续切片，片厚约5μm，行苏木精-伊红(HE)染色，甲苯透明，树胶封片，普通光学显微镜观察咬肌的组织学变化，并照相记录。

2. 结果

2.1 大鼠基本情况 睡眠剥夺1d 时，大鼠兴奋性提高，活动增多；睡眠剥夺5d 时，大鼠表现出“激惹”现象，有明显的攻击行为；至睡眠剥夺9d 时，大鼠表现为精神萎靡、呼吸频率加快、活动能力减退、对外界刺激反应明显减弱，呈极度虚弱表现，精神极差。大平台对照组及正常对照组大鼠则正常的饮食和水，体质量较实验前明显增加，对外界伤害性刺激反应灵敏准确。实验期间各组大鼠无意外死亡，全部进入实验结果分析。

2.2 大体标本观察 可见大鼠咬肌包括肌腱和肌腹两部分，表面包被结缔组织膜性结构，肌性部分由肌纤维组成，肉眼观察各实验组和对照组咬肌组织均色红而柔软，无显著差别。

2.3 HE 染色观察 正常对照组与大平台对照组无明显区别：咬肌细胞呈纤维状，粗细均匀、排列整齐，有明显横纹，无肌纤维排列紊乱或断裂(图1-A)；肌纤维无萎缩，无炎细胞浸润，无肌巨细胞；肌组织内部神经纤维无萎缩变性，血管无增生扩张；肌组织及其附丽结构正常。

睡眠剥夺1d 组：咬肌纤维排列稍有紊乱，肌横纹较模糊(图1-B)；肌纤维无萎缩断裂，间质内可见个别炎细胞浸润，未见肌巨细胞；肌组织内部血管轻微扩张，无玻璃样变性；肌组织及其附丽结构基本正常。

睡眠剥夺5d 组：咬肌纤维排列紊乱，粗细不均，肌横纹模糊或消失(图1-C)；个别肌纤维萎缩，未见断裂，间质中少量炎细胞呈弥散性分布，未见肌巨细胞；肌组织内部血管扩张增生，未见玻璃样变性(图1-D)。

睡眠剥夺9d 组：咬肌纤维排列紊乱，粗细不均，肌横纹消失(图1-E)；有肌纤维萎缩断裂现象，间质中有局灶性炎细胞浸润，可见个别肌巨细胞；肌组织内部血管扩张增生，出现玻璃样变性(图1-F)。

图1 对照组及各实验组大鼠咬肌组织形态学变化(HE，×400)

3. 讨论

在口颌系统的各种功能运动中，颞下颌关节、颌面部骨骼及口颌系统肌等均扮演着重要的角色，各结构相互配合、协同作用，从而保证口颌系统各项生理活动的正常运行。咀嚼肌作为口颌系统功能运动的动力结构，其组织结构的完整和生理功能的正常发挥是口颌系统各项生命活动正常进行的有力保证。与此同时，咀嚼肌的功能与颞下颌关节的功能息息相关，咀嚼肌结构和功能的改变会进一步对颞下颌关节造成影响。

咬肌是最主要的咀嚼肌之一，可以上提下颌并使之前伸，同时参与下颌的后退和侧方运动，在下颌功能运动中发挥着极其重要的作用。本课题组前期研究证实，睡眠剥夺作为一种内源性应激因素[7]，可以引起大鼠咬肌组织炎症指标和氧化应激指标的变化，其是否也会导致咬肌组织形态学的变化进而影响咬肌功能是本实验要解决的问题。本实验结果显示：在睡眠剥夺状态下，大鼠咬肌的组织形态学结构发生了明显变化，表现为肌纤维排列紊乱、粗细不均、肌横纹模糊或消失；随着睡眠剥夺时间的延长，出现肌纤维萎缩断裂、炎细胞浸润及肌组织内部血管的扩张增生。

睡眠剥夺可通过神经体液调节、能量消耗代谢、自由基生成增加和(或)清除能力降低、内质网应激等途径诱发机体的氧化应激反应[8-10]。同时，睡眠剥夺还可引起抗氧化酶的减少，从而导致机体抗氧化防御能力的降低，而氧化应激反应使机体内产生的过多氧自由基更进一步加重了该反应。肌组织中自由基生成的增加和清除能力不足之间的失衡导致自由基在体内的大量蓄积，而自由基水平的升高有可能会进一步引起肌肉的疲劳甚至损伤[11]。本课题组前期研究已经证实睡眠剥夺可导致大鼠咬肌组织中抗氧化指标的变化，我们推测正是由于机体抗氧化能力的不足进而使大鼠咬肌组织的组织形态学出现了病理性改变。

综上所述，睡眠剥夺可造成大鼠咬肌组织形态学的病理性改变，其机制可能与睡眠剥夺引起的机体氧化应激反应有关，而睡眠剥夺引起咀嚼肌损伤的确切机制尚须进一步的深入研究。

[1] 王培欢，吴高义，朱国雄. 睡眠剥夺对大鼠血清激素水平及咬肌炎症指标的影响[J].临床口腔医学杂志，2014，30(1): 6-8

[2] 王培欢，吴高义，朱国雄. 睡眠剥夺对大鼠咬肌氧化应激指标的影响[J].中华老年口腔医学杂志，2013，11(2): 79-82

[3] 王培欢，吴高义，朱国雄，等. 睡眠剥夺对大鼠咬肌超微结构的影响[J]. 现代生物医学进展，2013，13(16): 3045-3047

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