利扎曲普坦对硝酸甘油型偏头痛模型大鼠行为学和外周血中疼痛相关因子水平的影响

姚 刚,郝婷婷,罗翔丹,于挺敏

(1.吉林大学第二医院神经内科,吉林长春 130041;2.吉林大学第二医院核医学科,吉林长春 130041; 3.吉林大学第二医院营养部,吉林长春 130041)

利扎曲普坦对硝酸甘油型偏头痛模型大鼠行为学和外周血中疼痛相关因子水平的影响

姚 刚1,郝婷婷2,罗翔丹3,于挺敏1

(1.吉林大学第二医院神经内科,吉林长春 130041;2.吉林大学第二医院核医学科,吉林长春 130041; 3.吉林大学第二医院营养部,吉林长春 130041)

目的:观察利扎曲普坦对偏头痛模型大鼠行为学和外周血中疼痛相关因子的影响,探讨曲普坦类药物对偏头痛的治疗作用。方法:24只健康Wistar大鼠随机分为空白对照组、偏头痛组、利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组,每组6只。利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组大鼠给予利扎曲普坦灌胃,剂量为1 mg·kg－1·d－1(药物剂量根据成人常规每日口服剂量进行换算),空白对照组和偏头痛组大鼠给予生理盐水灌胃(1 m L·d－1)。各组大鼠连续灌胃给药7 d后,偏头痛组和利扎曲普坦治疗组大鼠制备硝酸甘油型偏头痛动物模型,空白对照组和利扎曲普坦对照组给予同剂量生理盐水,记录各组大鼠给予药物(硝酸甘油注射剂/生理盐水)后60～90 min行为学表现;2 h后处死大鼠,留取外周血,检测各组大鼠血清降钙素基因相关肽(CGRP)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。结果:与偏头痛组比较,利扎曲普坦治疗组大鼠行为学评分明显降低(P＜0.05)。与空白对照组比较,偏头痛组大鼠外周血中CGRP水平明显升高(P＜0.05);偏头痛组大鼠外周血中5-HT水平降低,但差异无统计学意义(P＞0.05);与空白对照组比较,利扎曲普坦对照组大鼠外周血中5-HT水平明显升高(P＜0.05);与偏头痛组比较,利扎曲普坦治疗组大鼠外周血中5-HT水平明显升高(P＜0.05);各组大鼠外周血中IL-1β和TNF-α水平无明显差异(P＞0.05)。结论:利扎曲普坦能够减轻硝酸甘油型偏头痛模型大鼠行为学症状,使偏头痛大鼠头痛发作期外周血中5-HT水平升高,改善偏头痛发作时血管舒缩功能紊乱的状态,减轻因5-HT耗竭而引起的血管过度扩张。

利扎曲普坦;降钙素基因相关肽;5-羟色胺;白细胞介素1β;肿瘤坏死因子α

目前研究[1-4]表明:偏头痛发作时患者外周血中5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等细胞因子、炎症介质的水平会发生不同的变化,而且这些变化可能与偏头痛的发生、持续等有关。曲普坦类药物是基于偏头痛发病的神经血管学说发展起来的一类治疗偏头痛的特异性药物,主要是作用于脑血管壁的5-HT1B/1D受体,收缩偏头痛发作时扩张的脑血管,其治疗机制是否涉及各种疼痛相关因子并不明确。本研究建立硝酸甘油型偏头痛大鼠模型,观察利扎曲普坦对硝酸甘油型偏头痛大鼠行为学症状的影响及其偏头痛发作期外周血5-HT、CGRP、IL-1β和TNF-α水平的变化,探讨曲普坦类药物对偏头痛的治疗作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器24只健康SPF 级Wistar大鼠(雌雄各半),体质量200～220 g,购于吉林大学基础医学院动物中心,动物合格证号:SCXK(吉)2003-001。苯甲酸利扎曲普坦(湖北华源世纪药业有限公司,产品批号:120301),硝酸甘油注射剂(山西康宝生物制品股份有限公司,产品批号:20120216),大鼠CGRP酶联免疫检测试剂盒、大鼠5-HT酶联免疫检测试剂盒、大鼠IL-1β酶联免疫检测试剂盒和大鼠TNF-α酶联免疫检测试剂盒均购自北京绿源博德生物科技有限公司。酶标仪(ELX800,美国Bio-Tek公司)。

1.2 动物分组和药物干预大鼠饲养于吉林大学第二医院动物实验室,室内温度22～26℃,相对湿度40%～60%,光暗周期12 h,自由摄取充足的水和食物,动物模型制备前适应性喂养7 d。将24只Wistar大鼠随机分为4组,每组6只:空白对照组、偏头痛组、利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组。利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组大鼠给予苯甲酸利扎曲普坦灌胃,剂量为1 mg·kg－1·d－1(药物剂量根据成人常规每日口服剂量进行换算),空白对照组和偏头痛组大鼠给予生理盐水灌胃(1 m L·d－1)。各组大鼠连续灌胃给药7 d后,偏头痛组和利扎曲普坦治疗组大鼠制备硝酸甘油型偏头痛动物模型。

1.3 硝酸甘油型偏头痛大鼠模型制备偏头痛组和利扎曲普坦治疗组大鼠臀部皮下注射硝酸甘油注射剂(10 mg·kg－1),制备实验性偏头痛动物模型,以给药大鼠出现前肢频繁挠头、爬笼次数增多、双耳发红、往返运动增多、咬尾等不适表现为造模成功的指标[5]。空白对照组和利扎曲普坦对照组大鼠臀部皮下注射生理盐水0.5 m L。

1.4 实验动物行为学表现评分记录各组大鼠给予药物(硝酸甘油注射剂/生理盐水)后60～90 min大鼠挠头、爬笼、咬尾和往返运动的次数总和(每个症状每出现1次计1分)[6]。

1.5 标本采集及检测指标硝酸甘油型偏头痛大鼠模型制备成功2 h后,各组大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉剂量:0.3 m L·100 g－1),右心耳采血(约4 m L),3 000 r·min－1离心10 min,分离并提取血清,－20℃冰箱中保存备用。检测各组大鼠血清中CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平,按试剂盒说明书操作,根据标准品的浓度及对应的吸光度(A)值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的A值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

1.6 统计学分析采用SAS统计学软件进行统计分析。各组大鼠行为学评分和血清CGRP、 5-HT、IL-1β、TNF-α水平以±s表示,组间比较采用F检验。

2 结果

2.1 硝酸甘油型偏头痛大鼠模型制备成功率偏头痛组和利扎曲普坦治疗组大鼠均出现前肢频繁挠头、爬笼次数增多、双耳发红、往返运动增多和咬尾等不适表现,造模成功率为100%。

2.2 各组大鼠行为学评分空白对照组(7.50± 2.78)和利扎曲普坦对照组(7.92±2.25)大鼠行为学评分明显低于偏头痛组(40.25±9.75)和利扎曲普坦治疗组(27.67±9.94)(P＜0.05),偏头痛组大鼠行为学评分明显高于利扎曲普坦治疗组(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠血清CGRP水平偏头痛组大鼠血清CGRP水平明显高于空白对照组(P＜0.05);利扎曲普坦对照组与空白对照组大鼠血清CGRP水平比较无明显差异(P＞0.05);偏头痛组与利扎曲普坦治疗组大鼠血清CGRP水平比较无明显差异(P＞0.05)。见表1。

2.4 各组大鼠血清5-HT水平利扎曲普坦对照组大鼠血清5-HT水平明显高于空白对照组和偏头痛组(P＜0.05);利扎曲普坦治疗组大鼠血清5-HT水平明显高于偏头痛组(P＜0.05);空白对照组和偏头痛组大鼠外周血中5-HT水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组大鼠外周血中5-HT水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.5 各组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平空白对照组、偏头痛组、利扎曲普坦对照组和利扎曲普坦治疗组大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

表1 各组大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

∗P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs migraine group.

Group CGRP 5-HT IL-1βTNF-α Control 39.22±14.37 85.27±31.56 5.80±2.29 169.10±27.60 Migraine 57.34±11.46∗59.25±46.71 4.45±2.92 131.80±52.64 Rizatriptan control 41.95±25.28 173.47±67.26∗△7.40±3.02 184.38±37.04 Rizatriptan treatment 40.51±25.32 160.32±87.99△7.95±3.54 169.82±58.72

3 讨论

硝酸甘油型偏头痛大鼠模型对于模拟偏头痛具有良好的信度和效度[7-9]。耳红、挠头、爬笼、咬尾和往返运动是硝酸甘油型偏头痛大鼠主要的行为学表现[10-12]。模型大鼠耳红症状与硝酸甘油的扩血管作用有关,因此本文作者在进行行为学计分时并未采纳此表现。本研究选择“爬笼、挠头、咬尾和往返运动”作为行为学评分的标准。研究[12]显示:造模60～90 min内模型大鼠行为学改变较为明显,且稳定,不适症状一般在3 h后逐渐消失。本研究对于模型大鼠的行为学变化观察时点选择在硝酸甘油造模后60～90 min,造模2 h时留取标本(头痛期内)。本研究中行为学评分结果显示:偏头痛组大鼠行为学改变最明显,利扎曲普坦治疗组大鼠上述行为学改变也较为明显,但明显轻于偏头痛组大鼠,2组大鼠行为学评分比较差异有统计学意义,证实利扎曲普坦能够减轻硝酸甘油型偏头痛大鼠的行为学症状。偏头痛发病机制的三叉神经血管学说[13-14]认为:CGRP与偏头痛的发生有密切关联。CGRP受体拮抗剂对偏头痛也有满意的治疗效果[15]。临床研究[2]发现:偏头痛发作时外周血中CGRP水平升高,而且偏头痛的强度和持续时间与血中CGRP水平呈正相关关系。但也有研究[3]发现:在头痛期和头痛缓解期CGRP水平降低或无明显变化。对于上述情况,学者们推测与留取血样标本的时机有关:头痛初期,CGRP由神经末梢大量释放,而头痛持续一段时间,CGRP经过代谢而减少,因此认为外周血中CGRP在偏头痛发病过程中存在较大的波动[3]。本研究结果显示:硝酸甘油注射剂制备的偏头痛大鼠模型,在2 h时采血(头痛发作期),外周血中CGRP水平升高,进一步证实偏头痛发作期血清CGRP升高的这一现象;利扎曲普坦给药组大鼠外周血中CGRP水平与空白对照组比较无明显改变,说明利扎曲普坦对外周血中CGRP水平无明显影响。

Nagata等[4]报道:有先兆偏头痛患者血清5-HT水平明显降低,而无先兆偏头痛患者血清5-HT与对照组比较差异无统计学意义,从而认为有先兆偏头痛患者5-HT代谢失调可能与无先兆偏头痛患者5-HT的代谢状态不同。付秋菊等[16]发现:硝酸甘油型偏头痛大鼠血清5-HT水平明显下降,给予实验药物痛宁胶囊治疗后,血清中5-HT水平明显升高,从而认为此药是通过升高外周血中5-HT水平以治疗偏头痛。本研究结果显示:偏头痛组大鼠外周血中5-HT水平与对照组比较差异无统计学意义,但有下降趋势,这可能与样本量较少有一定的关系;利扎曲普坦对照组大鼠外周血中5-HT水平明显高于空白对照组,利扎曲普坦治疗组大鼠外周血中5-HT水平明显高于偏头痛组,提示利扎曲普坦能够影响外周5-HT系统的代谢状态,提高偏头痛大鼠头痛发作期外周血中5-HT水平,减轻因5-HT耗竭而引起的血管过度扩张。

外周血中IL-1β和TNF-α均能够引起P物质、一氧化氮等物质增加,进而诱发血管通透性增加、血管舒张、血浆外渗以及肥大细胞脱颗粒等病理改变[17],引发疼痛。目前研究[18]认为:IL-1β和TNF-α在炎性疼痛和癌症疼痛过程中起着至关重要的作用,而本研究并未发现硝酸甘油型偏头痛大鼠头痛发作期外周血中IL-1β和TNF-α有明显的异常改变,本文作者推测IL-1β和TNF-α与偏头痛病理生理过程的关系可能并不密切,这与偏头痛的发病机制有关,偏头痛的疼痛病理过程有别于炎性疼痛和癌症疼痛等其他疼痛。

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Effects of rizatriptan on behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of rat models with nitroglycerin-type migraine

YAO Gang1,HAO Ting-ting2,LUO Xiang-dan3,YU Ting-min1
(1.Department of Neurology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;2.Department of Nuclear Medicine,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;3.Department of Nutrition, Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China)

ObjectiveTo observe the influence of rizatriptan on the behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of the migraine model rats,and to investigate the theraputic effect of rizatriptan on migraine.MethodsA total of 24 rats were randomly divided into:control group,migraine group,rizatriptan control group and rizatriptan treatment group.The rats in rizatriptan control and rizatriptan treatment groups were intragastrically perfused with rizatriptan,1 mg·kg－1per day(according to the adult daily dose),and the rats in control andmigraine groups were perfused with normal saline,1 m L per day.After 7 d,nitroglycerin was subcutaneously injected into the buttocks of the rats in rizatriptan treatment and migraine groups to induce migraine.Normal saline was injected into the rats in control and rizatriptan control groups.At 60－90 min following nitroglycerin injection, the total number of behavioral symptoms was measured.The serum calcitonin gene-related peptide(CGRP),5-hydroxytryptamine(5-HT),interleukin-1β(IL-1β),and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels were determined using ELISA.ResultsCompared with migraine group,the behavioral score of the rats in rizatriptan treatment group was significantly decreased(P＜0.05).The serum CGRP level of the rats in migraine group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).Compared with control group,the serum 5-HT level of the rats in and migraine group was decreased,but there was no significant differece(P＞0.05);the serum 5-HT level in rizatriptan control group was significantly increased(P＜0.05).The serum 5-HT level of the rats in rizatriptan treatment group was significantly increased compared with migraine group(P＜0.05).The serum IL-1βand TNF-α levels of the rats in varions groups had no significant differences(P＞0.05).ConclusionRizatriptan can relieve the behavior symptoms in nitroglycerin-induced migraine model rats,increase the serum 5-HT level,improve the vasomotor disturbance,and relieve the angiectasis.

rizatriptan;calcitonin gene-related peptide;5-hydroxytryptamine;interleukin-1β;tumor necrosis factor-α

R747.2;R-332

A

2014-01-02

吉林省卫生厅青年科研基金资助课题(2013Q020);吉林大学白求恩青年科研基金资助课题(2013206044)

姚 刚(1983－),男,陕西省勉县人,主治医师,医学博士,主要从事慢性头痛的基础与临床研究。

于挺敏(Tel:0431-88796298;E-mail:ytm_396＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0981-04

10.13481/j.1671-587x.20140515