添加不同碳氮源对蛹虫草子实体生长的影响

秦俊哲， 殷 红， 任金玫

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

蛹虫草(Cordycepsmilitaris)又称北冬虫夏草，属真菌门((Eumy cota )，麦角菌科(Claviciptiaceae)，虫草属(Cordyceps)[1].其主要药用成分为虫草酸、虫草素、虫草多糖和SOD等，具有与天然冬虫夏草相似的药用和滋补功效，有些重要活性成分还明显高于冬虫夏草[2].它可以作为冬虫夏草的理想替代品[3].

蛹虫草子实体是其主要功效成分载体，近年来蛹虫草人工栽培技术获得一定程度的发展，在麦粒、大米、玉米渣、麸皮等为培养基上生长的蛹虫草都有所报道[4-8].麦粒作为基础培养基应用广泛而且廉价，是栽培蛹虫草的理想原料.但以麦粒作为主料还需补充哪些辅助的营养物质还尚未定论，本文以CM2为实验菌株，麦粒为基础培养基，研究添加不同营养物质对菌丝及子实体生长的影响，为筛选适合蛹虫草生长的培养基提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：蛹虫草CM2为陕西科技大学微生物研究室提供.

1.2 实验配方

①固体斜面培养基： PDA加富培养基；②液体培养基：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB12片，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH；③固体栽培培养基：小麦粒30 g，蚕蛹粉2 g，营养液：马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH，料液比为1∶1.5.

1.3 实验方法

(1)斜面菌种扩培

将活化好的蛹虫草菌种分别接入固体斜面培养基，以葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇为碳源，编号为1、2、3、4、5，无碳源的记为6，以蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、氯化铵、硫酸铵为氮源编号为7、8、9、10、11，无氮源的记为12，每个处理做5个平行，常规灭菌，冷却后在无菌室内将供试菌种分别接入斜面培养基，在22 ℃恒温培养箱中暗室培养7 d,观察菌丝形态，测定菌丝生长速度.

(2)液体菌种制作

取斜面约0.5 cm2的三块菌种接入装有100 mL高压灭菌冷却后的液体培养基中，在22 ℃、180 r/min条件下培养7 d.

表1 菌丝在不同碳源斜面上的菌丝长势

注：+++代表菌丝健壮，致密；++代表菌丝较健壮，较致密；+代表菌丝瘦弱，纤细，稀疏.

(3)实验配方设计

以固体栽培培养基为对照，分别添加葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇为碳源，编号为1、2、3、4、5，无碳源的记为6，添加蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、氯化铵、硫酸铵为氮源，编号为7、8、9、10、11，无氮源的记为12，分别加入500 mL罐头瓶中，在0.1 Mpa压力下121 ℃灭菌90 min，冷却后，接入液体菌种，22 ℃下培养观察菌丝生长状况，测量子实体干重，并记录.

(4)虫草菌素含量的测定[9]

样品制备：称取样品0.300 g，加蒸馏水20 mL，超声波提取20 min，过滤，滤液用50%乙醇定容至100 mL，在紫外分光光度计259 nm下检测.

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对斜面菌丝生长的影响

将活化好的蛹虫草菌种分别接入不同的碳源培养基上，菌丝生长速度和长势结果如图1和表1所示.从图1和表1可以看出蛹虫草CM2在5种碳源的培养基上均能生长，但菌丝体生长速度不同.在葡萄糖和蔗糖为碳源的培养基上，菌丝的平均生长速度分别可达到3.47 cm/d和3.44 cm/d，且菌丝健壮浓密，洁白有光泽.以甘露醇和可溶性淀粉为碳源的次之，乳糖和对照组的菌丝长速最慢，长势最差.因此，确定葡萄糖和蔗糖为菌丝生长的较适碳源.

图1 菌丝在不同碳源斜面上的生长速度

2.2 不同氮源对斜面菌丝生长的影响

将活化好的蛹虫草菌种分别接入不同的氮源培养基上，菌丝生长速度和长势结果如图2和表2所示.从图2和表2可以看出蛹虫草CM2不仅可以利用有机氮源，还可以利用无机氮源，相比之下，有机氮源更有利于菌丝的生长.在以蛋白胨和黄豆粉为氮源时，菌丝的平均生长速度可分别达到3.26 cm/d和3.07 cm/d，菌丝生长健壮，致密，洁白有光泽.以硫酸铵、氯化铵、酵母粉为氮源时，菌丝生长相对缓慢，但酵母粉优于硫酸铵和氯化铵.综合比较可得，蛋白胨为较适的氮源.

图2 菌丝在不同氮源斜面上的生长速度

培养氮源7蛋白冻8酵母粉9黄豆粉10氯化铵11硫酸铵12CK菌丝长势+++++++++++

2.3 不同碳源对固体栽培蛹虫草子实体的影响

图3 不同碳源对子实体产量及虫草素的影响

(a) 葡萄糖 (b) 乳糖

(c) 淀粉 (d) 蔗糖

(e) 甘露醇 (f) CK图4 添加不同碳源对子实体形态的影响

将液体菌种分别接入不同的碳源固体栽培培养基上，子实体的干重、虫草素含量和形态变化情况如图3和图4所示.从图3可以看出，可溶性淀粉和蔗糖是合适的碳源，子实体密集，粗壮，以100 g培养料为基础子实体的产量分别为51.3 g和57 g.虫草素含量分别为13.87 mg/g和15.76 mg/g，其次是葡萄糖、甘露醇、乳糖，说明同一种碳源对蛹虫草菌丝体生长、子实体分化发育的影响是不同的，有利于菌丝的生长，不一定能得到最大的子实体产量.甘露醇在试验中对比最明显.

这是由于菌丝生长的培养基内只添加了单一的碳源，而栽培子实体的固体小麦培养基质内还含有营养成分，麦粒中淀粉含量高而蛋白质含量低属难吸收大分子.故在麦粒基质中添加可溶性易吸收的小分子糖，子实体在生长中可以更好地吸收利用.与葡萄糖相比，蔗糖促进代谢的效果更好，而乳糖和甘露醇对促进菌丝生长没有明显作用.结合生产需要，选用单一的麦粒基质不利于子实体生长，应该在基础培养基中选择添加蔗糖或者可溶性淀粉等碳源，以获得产量更高的子实体.

2.4 不同氮源对固体栽培蛹虫草的影响

将液体菌种分别接入不同的氮源固体栽培培养基上，子实体的干重、虫草素含量和形态变化情况如图5和图6所示.

图5 不同氮源对子实体产量及虫草素的影响

(a) 蛋白胨 (b) 酵母粉

(c) 黄豆粉 (d) 氯化铵

(e) 硫酸铵 (f) CK图6 添加不同氮源对子实体形态的影响

由图5可以看出，有机氮源对促进子实体的生长作用明显优于无机氮源，培养到第5 d时，菌丝已经长满罐头瓶表面，且健壮浓密.从子实体的产量和虫草素含量可以看出，有利于菌丝生长的有机氮源同样有利于子实体发育.以蛋白胨、酵母粉、黄豆粉为氮源时子实体在每100 g培养料中的产量分别可达55.67 g、47 g和54.67 g.虫草素含量分别为14.32 mg/g，12.73 mg/g，14.26 mg/g，并且以蛋白胨为氮源时子实体粗壮，色泽橙红，质量高，酵母粉和黄豆粉子实体长势次之.

有机氮源中所含的有蛋白质、氨基酸等营养物质更利于真菌生长，而麦粒培养基质中也含有少量氮源，可以短暂补充微生物所需的营养.菌体在利用碳源的同时也需要一定的氮源来维持正常生命代谢活动.蛋白胨是蛋白质的水解产物，富含有机氮化合物以及糖类和维生素，是最易吸收的氨基态氮可以促进子实体生长，因此是理想的氮源；酵母粉与黄豆粉都属于有机氮，但黄豆粉为机体直接吸收利用但营养物质不及蛋白胨；无机氮氯化铵和硫酸铵其成分单一，可以被快速利用，在子实体生长中消耗较快，不能满足菌体需求.结合产量和质量考虑，蛋白胨为最适氮源.

3 结论

实验结果表明，适合蛹虫草CM2菌丝生长的培养基组成为马铃薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH.适合子实体生长的培养基组成为麦粒30 g，蚕蛹粉2 g，营养液：马铃薯(去皮)200 g，蔗糖20 g，蛋白胨5 g，VB120 mg，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，水1 000 mL，自然pH，料液比为1∶1.5. 此结论与陈磊[10]得到蛹虫草菌丝在培养时最适的碳源、氮源不同.与秦秀丽[11]等人对固体栽培培养基优化类似.不同碳氮源对蛹虫草菌丝生长和子实体产量均有一定的影响，不同的蛹虫草菌可能由于菌种差异而选择不同的碳氮源.以麦粒为基质，碳氮比达不到生长要求，所以为弥补菌体的生长添加不同的碳氮源，从而促进子实体生长.对于不同的蛹虫草生长所需要的营养及生长条件还需要进一步研究.

[1]Sung G H，Hywel Jones N L，Sung J M，et al．Phylogenetic classification of cordyceps andthe clavicipitaceous fungi[J]．Studies in Mycology，2007,57:559.

[2]桂仲争，疼国琴，贾俊强，等.蛹虫草食药用开发价值[J].中国食物与营养，2012,18(3)：70-73.

[3]张红霞，吴 畏，陈 伟，等．北冬虫夏草发酵液中虫草素和腺苷含量的HPLC分析[J]．上海农业学报，2005,21(4)：53-56.

[4]张显科，刘文霞．不同培养料栽培蛹虫草实验研究[J]．中国食用菌，1997,16(2)：21-22．

[5]刘守华，王 栩．蛹虫草的代料栽培试验研究[J]．辽宁师专学报(自然科学版)，1999，1(4)：91-92．

[6]Kim S W，Hwang H J，Xu C P.Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738[J].Journal of Applied Microbiology，2003,94:120-126.

[7]Xie C Y，Gu Z X，Fan G J，et al.Production of Cordycepin and mycelia by submerged fermentation of Cordyceps militaris in mixture natural culture[J]．Applied Biochemical Biotechnology，2009,158:483-492.

[8]王金寿.不同配方培养料栽培蛹虫草比较试验[J].食用菌，2011,33(6):33-34.

[9]王美娟，李多伟，王义潮，等.蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究[J].西北植物学报，2005,25(9)：1 863-1 867.

[10]陈 磊，蛹虫草(Cordycepsmilitaris)生物学特性及发酵研究[D].北京：北京协和医学院,2009.

[11]秦秀丽，邢 力，尹 锐.北冬虫夏草人工培养固体培养基优化研究[J].北方园艺，2013,37(6)：149-152.