通脑溶栓胶囊对大鼠血栓形成和血液流变学的影响

2014-06-27王红英黄琳红马耀茹贺建宇

西安交通大学学报（医学版） 2014年1期

王红英，黄琳红，马耀茹，贺建宇

(1. 西安交通大学医学院药物研究所，陕西西安 710061；2. 西安交通大学医学院附属红会医院，陕西西安 710054；3. 西安洲良明康生物医药科技有限公司，陕西西安 710075)

中风是中老年的常见病、多发病，是当今世界对人类危害最大的3种疾病之一，具有发病率高、死亡率高、致残率高、复发率高以及并发症多的“四高一多”特点。近年来，由于诊疗水平的提高，中风的死亡率有所降低，但致残率仍居高不下，约80%的存活者尚有不同程度的功能障碍，即中风后遗症，给患者家庭和社会带来了沉重的负担[1]。有研究表明，血液流变学状态的改变在心脑血栓形成至最终发展为心脑梗死的过程中起到重要作用[2]。通脑溶栓胶囊由黄芪、粉葛、川芎、桃仁、鸡血藤、地龙等中药材组成的中药新药，具有益气活血、化瘀通络之功效，临床主治中风恢复期(脑梗死)所致的半身不遂、口眼歪斜、偏身感觉麻木、肢体痉挛、语言不利等属气虚血瘀证者。本研究通过制备大鼠体内血栓模型，观察通脑溶栓胶囊对体内血栓形成和血液流变学的影响，探讨其活血化瘀的作用机制，为该复方制剂的进一步开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药品、试剂与仪器通脑溶栓胶囊(陕西博森生物制药股份集团有限公司，规格：0.4 g/粒，批号：081201)；血栓心脉宁胶囊(吉林华康药业股份有限公司，规格：0.5 g/粒，批号：081102)；3 g/L戊巴比妥钠(北京化学试剂公司，批号：060222)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，成都科龙化工试剂厂，批号：20081120)；磷酸缓冲液、EDTA缓冲液、EDTA-甲醛缓冲液；100 g/L高分子右旋糖酐(DEXTRAN500，Amersham Biosciences，批号：301622)；5 g/L肝素生理盐水溶液(天津市生物化学制药厂，批号：20120205)；EDTA(浙江拱东医用塑料厂，批号：0603147)。多道生理机能仪(成都仪器厂，型号：6280C)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，AB204-N)；血细胞自动分析仪(日本光电公司，MEK-6318K)；血凝仪(中山市培康医疗电子有限公司，PK-B)；台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂，TGL-16G)；血黏度分析仪(北京宏润科技发展有限公司，型号：YDA-IV)；100 g/L水合氯醛(分析纯，西安交通大学医学院第二附属医院药剂科)。

1.2实验动物SD大鼠，体质量200～300 g，雌雄各半，购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物生产资格证号：SCXK(陕)2007-001，动物使用许可证号：SYXK(陕)2007-003。动物颗粒饲料喂养，自由饮水。

1.3方法

1.3.1动物分组及给药方法将3批各50只SD大鼠随机分为5组：阴性对照组、阳性对照组(血栓心脉宁胶囊)及通脑溶栓胶囊低、中、高剂量组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组灌胃给予5 g/L的CMC-Na，其余各组给予对应的受试品CMC-Na混悬液，按1 mL/100 g 给药，1次/d，分别进行动、静脉血栓模型及血小板聚集实验；另取60只大鼠随机分为6组：对照组、模型组、阳性组及通脑溶栓胶囊低、中、高剂量组，每组10只，雌雄各半，进行血瘀大鼠血液流变学实验。

1.3.2颈总动脉血栓模型的制备[3]连续给药25 d后，腹腔注射3 g/L戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，颈正中切口，分离、动脉夹结扎双侧颈总动脉。缺血1 h后灌胃给药，继续缺血1 h后解除动脉夹实施再灌注，血流再通，缝合切口，自由饮食饲养24 h。电流设定4 mA，刺激时间7 min，之后缝合皮肤，回笼饲养，手术均为无菌操作。再连续灌胃给药5 d，末次给药1 h后，再次麻醉大鼠，颈正中切口，取出包含血栓的颈总动脉，分离血栓，在滤纸上吸干血液与水分，称量血栓重量。

1.3.3静脉血栓模型的制备[4]连续给药30 d后，腹腔注射100 g/L水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，腹中线切口，分离下腔静脉，用粗线于左肾静脉下方结扎下腔静脉，缝合切口。4 h后，重新打开腹腔，在结扎下方2 cm处夹闭管腔，剖开该段管腔，并将管腔内血液吸尽，取出血栓，放滤纸上，吸干血液，称量血栓湿重。

1.3.4血小板聚集及凝血指标的测定[5]连续给药30 d，末次给药30 min后，腹腔注射戊巴比妥钠(1 mL/100 g)麻醉，用内径1 mm的玻璃毛细管插入鼠内眦静脉丛取血，至毛细管血柱达5 cm。每隔30 s折断毛细管一段，检查有无出现凝血丝，计算毛细管采血到出现凝血丝的时间，即为凝血时间。然后仰卧位固定大鼠，开腹暴露腹主动脉和下腔静脉，用分别装有2 mL EDTA缓冲液和EDTA-甲醛缓冲液的5 mL注射器下腔静脉采血0.5 mL，弃去注射器头部的血液约0.1 mL，将余下的血液分别注入5 mL塑料离心管中，混匀，室温放置15 min，以500 r/min离心10 min，取上层血浆，测定血小板计数(PLT)，计算血小板聚集率(PAgT)。

PAgT=[PLT(EDTA缓冲液)-PLT(EDTA-甲醛缓冲液)]/PLT(EDTA缓冲液)×100%。

另用32.1 g/L柠檬酸钠和EDTA·K2真空采血管分别从腹主动脉采血，立即测定凝血酶时间(TT)、血浆凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。

1.3.5血液流变学指标的测定连续给药30 d，末次给药后1 h，各组大鼠尾静脉注射100 g/L高分子右旋糖酐(0.5 mL/100 g)，15 min后，腹主动脉取血6～7 mL，1 mL全血EDTA抗凝测定红细胞压积(HCT)，0.8 mL全血肝素抗凝测定全血黏度，剩余血液3 000 r/min离心15 min，测血浆黏度。

2 结果

2.1通脑溶栓胶囊对大鼠体内血栓形成的影响与阴性对照组比较，阳性对照组的颈动脉血栓湿重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明实验方法可靠。与阴性对照组比较，通脑溶栓中、高剂量组动脉血栓湿重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01，表1)。

与阴性对照组比较，阳性对照组的下腔静脉血栓湿重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，说明实验方法可靠。与阴性对照组比较，通脑溶栓低、中、高剂量组静脉血栓湿重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01，表2)。

表1通脑溶栓胶囊对大鼠体内动脉血栓形成的影响

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表2通脑溶栓胶囊对大鼠体内静脉血栓形成的影响

Tab.2 Effects of Tong-nao thrombolysis capsule on venous thrombosis in rats

n=10)

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2通脑溶栓胶囊对大鼠血小板聚集及凝血功能的影响与阴性对照组比较，阳性对照组血栓心脉宁胶囊可延长凝血时间及PT，降低PAgT，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；通脑溶栓胶囊低剂量组可延长APTT，差异有统计学意义(P<0.01)；通脑溶栓胶囊中剂量组能延长血凝时间及PT，降低PAgT，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；通脑溶栓胶囊高剂量组，可延长PT及APTT，降低PAgT，差异均有统计学意义(P<0.01，表3)。

表3通脑溶栓胶囊对大鼠凝血时间、血小板功能及抗凝血作用的影响

与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3通脑溶栓胶囊对血瘀大鼠血液流变学的影响与阴性对照组比较，大鼠尾静脉注射100 g/L高分子右旋糖酐后，模型对照组的各项血液流变学指标均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)，说明血瘀模型制备成功。与模型对照组比较，阳性对照组和通脑溶栓高剂量组的全血高切变率、中切变率、低切变率及血浆黏度均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)，通脑溶栓中剂量组的全血高切变率、中切变率及血浆黏度均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。

表4通脑溶栓胶囊对血瘀大鼠模型血液流变学的影响

与模型对照组比较，*P<0.05；**P<0.01。

3 讨论

脑梗死是缺血性脑血管疾病，血栓或栓塞性血管阻塞在缺血性脑血管疾病的发病中起着十分重要的作用[6]，目前缺乏理想的治疗药物。在中医理论中，对缺血性脑梗死病因病机的认识有多种学说，如痰瘀互结、痰热腑实、肝风内动、肾气虚弱等，但大多数学者仍倾向于气虚血瘀是缺血性中风的主要病因病机。也就是说，血液的高黏、高凝、高聚状态，血液流变学指标发生异常，血液黏度增高、纤维蛋白原显著增加、红细胞变形能力降低，是血栓形成导致脑梗死的重要因素[7]。

益气活血法是治疗中风病的基本治法，益气为治本之法，活血为治标之法[8]。益气使人体气机充沛，功能正常，气血调和，正气强盛；活血化瘀可使经络通畅，气血调畅，郁火不生，清窍、脑络不受蒙蔽。本研究中的通脑溶栓胶囊是由黄芪、粉葛、川芎、桃仁、鸡血藤、地龙等中药材组成的中药新药，具有益气活血、化瘀通络之功效。黄芪有益气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。现代药理实验表明，黄芪使冠状血管和肾脏血管扩张，并使全身末梢血管扩张，皮肤循环畅盛，使高血压患者血压下降[9]。而葛根的有效成分大豆黄酮等可明显促进脑、冠脉循环，改善肾上腺素所致微循环障碍，并对缺血心肌有保护作用[10]。文献报道[11],桃仁提取液能明显增加脑血流量，降低血管阻力，改善血流动力学状况，桃仁可使小鼠的出血及凝血时间明显延长，煎剂对体外血栓有抑制作用。鸡血藤有散气、活血、舒筋、活络等功效。研究发现，鸡血藤生药水煎醇沉剂可明显抗血小板聚集[12]。

本研究结果表明，通脑溶栓胶囊对大鼠实验性血栓形成有显著的抑制作用，表明通脑溶栓胶囊能降低活体动物动脉血流中血小板黏附聚集功能；同时，通脑溶栓胶囊对大鼠凝血功能有一定影响，可降低血小板聚集率，明显延长凝血时间、PT及APTT，对血液流变学指标也有明显的改善作用，能显著降低高分子右旋糖酐所致大鼠血瘀模型的血液黏度，改善血液循环，从而有效地避免了血栓形成的潜在风险，充分体现了通脑溶栓胶囊所具有的活血化瘀、通络的功能。但其确切的作用机制有待于进一步的研究。

参考文献：

[1] 韦国麟，崔明，秦清，等. 复方银杏滴丸对大鼠体内溶栓作用研究[J]. 中国医药导报, 2008, 6(5):15-16.

[2] 吴剑萍，桂玲，李琴，等. 抗血栓片对大鼠血栓形成和血液流变学的影响[J]. 中国医院药学杂志, 2008, 28(17):1448-1450.

[3] 方伟，廖诗平，钟晖，等. 皂角皂苷对大鼠血栓形成及微循环障碍的影响[J]. 中药药理与临床, 2009, 25(5):76-79.

[4] 覃洁萍，王乃平，钟正贤，等. 杨梅素分散片对大鼠实验性脑缺血的保护作用及对血栓形成的影响[J]. 时珍国医国药, 2009, 20(1):58-60.

[5] 徐叔云，卞如濂，陈修. 药理实验方法学[M]. 3版. 北京：人民卫生出版社, 2002:1070-1073.

[6] 谭滢，王磊，周有利，等. 脑梗死患者高压氧治疗前后的血脂及血液流变学指标分析[J]. 微循环杂志, 2007, 17(4):55-57.

[7] 赵红梅，于晓风，曲绍春，等. 麝香抗栓丸对实验性脑缺血大鼠血小板功能及血液黏度的影响[J]. 吉林大学学报：医学版, 2004, 30(3):393-395.

[8] 王兵. 益气活血法治疗缺血性中风的研究近况[J]. 辽宁中医药大学学报, 2007, 9(1):162-163.

[9] 宋锦叶，孟立强，李晓玫. 黄芪与当归在肾脏微血管病变中的治疗应用前景[J]. 中国中西医结合杂志, 2008, 28(9):859-861.

[10] 蔡小军，许惠琴. 葛根注射液对麻醉犬急性心肌缺血的保护作用[J]. 中华中医药学刊, 2007, 25(12):2616-2618.

[11] 赵强，李莹，孔令升，等. 王廷璞桃仁化学成分及药理作用研究进展[J]. 天水师范学院学报, 2008, 2(2):56-59.