乌司他丁对肝大部切除合并缺血再灌注损伤后 肝再生和能量代谢的影响

谭 敬，朱宇麟，周荣胜，张晓琪，赵 鸽，刘齐宁

(西安交通大学医学院第一附属医院麻醉科，陕西西安 710061)

肝大部切除术中常使用肝门阻断法减少术中出血，常不可避免地造成肝缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)。IRI不但造成肝细胞死亡，也会使肝再生能力受损[1]。肝再生的调控是一个非常复杂的过程，不但有众多细胞因子参与，而且DNA合成、细胞周期转化、有丝分裂都是能量消耗过程因此维持稳定的能量代谢是维持肝再生的重要方面。乌司他丁(Ulinastatin, UTI)，一种尿胰蛋白酶抑制剂，具有抑制多种酶(胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明质酸酶、弹性蛋白酶等)的活性，在治疗胰腺炎、抗肿瘤、抗休克和肝脏切除围手术期等方面已经引起了广泛的重视。以往研究证实UTI对肝IRI具有良好的保护作用[2]。我们也发现UTI对肝IRI后的肝再生有保护作用[3]。但是，UTI对肝再生影响的机制尚未完全清楚。本研究拟在建立大鼠70%肝大部切除合并IRI模型的基础上，观察UTI对肝再生过程中能量代谢的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物健康清洁级雄性SD大鼠120只，3月龄，体质量230～280 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2试剂及仪器乌司他丁由广东天普生化医药股份有限公司提供(批号03091123)；AnnexinV/FITC细胞凋亡试剂盒购自珠海健康元生物医药有限公司；兔抗鼠细胞核增殖抗原(PCNA)抗体试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；ATP、ADP、AMP标准品购自美国Sigma公司；全自动生化分析仪购自日本Olympus公司；流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司；高压液相色谱仪购自美国HP公司。

1.3方法

1.3.1动物分组和模型制备 120只大鼠随机分为三组，分别为单纯肝切除组(PH)、肝切除合并缺血再灌注组(PHIR) 和乌司他丁组(UTI)，每组40只。大鼠术前禁食8 h，不禁饮。100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，经阴茎背静脉注入稀释肝素(500 U/kg)，使其肝素化。仰卧位固定四肢，灯照保暖，常规剔毛消毒，取剑突下腹正中纵行切口约3 cm，依次切开腹壁各层进入腹腔，显露肝十二指肠韧带，以3-0丝线结扎肝左、中叶根部，行左、中叶肝脏切除术，约占70%肝总体积。保留肝(肝右、尾叶)作不同处理：PH组不阻断保留肝叶血流；PHIR组在切除肝左、中叶的同时用小号无损伤动脉夹阻断肝右、尾叶的血流30 min，后恢复其血流；UTI组与PHIR组肝脏切除及保留肝断流处理相同，但于缺血前5 min经尾静脉给予UTI 50 000 U/kg。术后皮下注射含青霉素的生理盐水2 mL(80 000 U/mL)预防感染。各组分别于再灌注后1、6、12、24和48 h采集下腔静脉血4 mL和肝右叶相同部位肝组织约3 g进行各项指标检测，每时点8只大鼠。

1.3.2检测指标 ①丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)：将各时点采集的大鼠下腔静脉血，以半径20 cm、4 000 r/min(35 000 g)离心10 min，分离上层血清，全自动生化分析仪检测ALT和AST活性。②肝细胞凋亡指数(apoptosis index, AI)：取储存肝组织1.0 g，解冻后制备肝细胞悬液，经消化、计数，取(3～5)×105个细胞置于流式管中，PBS液洗涤离心2次。加入稀释的结合缓冲液100 μL，吹打混匀后加入5 μL的AnnexinV/FITC和10 μL的碘化丙啶(PI)，室温下避光反应15 min。再加入400 μL PBS吹打混匀后上流式细胞仪检测细胞的凋亡指数。③残肝再生度：按SHERGILL等[4]提供的方法略加修改计算肝再生度。大鼠肝脏左、中叶切除后立即称重(B)，用以计算大鼠初始肝重(A=B/0.7)，即切除肝重为初始肝重的70%。预定时点处死大鼠后，切下全部保留肝组织并称重(C)。肝再生度计算公式为：肝再生度=[(C-0.3×A)/A]×100%。④残肝组织PCNA：采用免疫组化法测定再灌注后24和48 h两时点肝组织PCNA，按PCNA免疫组化试剂盒提供的方法制备肝细胞切片和PCNA染色，以胞核呈现界限清楚的棕黄色为阳性细胞。每只大鼠取5张切片，光镜下每张切片随机挑选10个200倍视野，计数每个视野中100个肝细胞中含有的阳性细胞数，计算各组平均PCNA阳性百分率。⑤肝组织ATP、ADP和AMP的含量和能量负荷：采用高压液相色谱法测定ATP、ADP和AMP的含量，将ATP、ADP和AMP标准品稀释成外标母液备用。取术后24、48 h大鼠肝组织1 g，液氮研磨后加20倍体积0.4 moL/L的HClO4制取匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心5 min，取上清。再用2.5 moL/L的K2CO3调pH至中性，4 ℃、4 000 r/min离心5 min，取上清检测ATP、ADP和AMP的浓度。色谱条件为ODS柱(250×4.6 id 5 μm)，流动相为0.05 moL/L磷酸盐缓冲液与甲醇，室温条件下流速1.0 mL/min，UV 254 nm，ATT-3，吸收率0.02，纸速0.5 cm/min，进样量10 μL。组织能量负荷公式为([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])[5]。

1.3.3统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，组间先进行方差齐性检验，若组间方差齐，则组间两两比较采用LSD-t检验，并行药物处理和时间交互作用检验；若组间方差不齐，则采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1UTI抑制了IRI后血清ALT、AST活性升高PH组ALT、AST活性于再灌注早期逐渐升高，12 h达高峰，随后逐渐下降。与PH组比较，PHIR组各时点ALT、AST活性升高更加明显(P<0.05)。UTI组各时点ALT、AST活性较PHIR组有所降低，且差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。不同处理与时间交互作用的差异无统计学意义。

表1各组不同时点血清ALT、AST活性的比较

Tab.1 Serum ALT and AST activities in each group at different time points after reperfusion

n=8)

与PH组比较，*P<0.05；与PHIR组比较，#P<0.05。

2.2UTI减轻了IRI引起的肝细胞凋亡PHIR和UTI组再灌注后AI逐渐升高，12 h达峰值，随后下降。与PH组相比，PHIR组AI于6 h到48 h明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。与PHIR组相比，UTI组AI于再灌注6 h到24 h明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05，表2)。不同处理与时间交互作用的差异无统计学意义。

2.3UTI减轻了IRI对肝再生的抑制与PH组比较，PHIR组术后24、48 h肝再生度降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，UTI组肝再生度虽然下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；与PHIR组比较，UTI组术后24、48 h肝再生度升高，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。与PH组比较，PHIR组术后24、48 h PCNA表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，UTI组PCNA虽然下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；与PHIR组比较，UTI组术后24、48 h PCNA表达水平升高，差异具有统计学意义(P<0.05)(表3、图1)。

表2各组不同时点残肝组织细胞凋亡指数(%)的比较

Tab.2 Apoptosis index of the regenerated liverin each group at different time points

n=8)

与PH组比较，*P<0.05；与PHIR组比较，#P<0.05。

表3各组24、48h肝再生度和PCNA阳性率的比较

Tab.3 Regenerated liver weight and PCNA positivity rate in each group at 24h and 48h after reperfusion

n=8)

与PH组比较，*P<0.05 ；与PHIR组比较，#P<0.05。

2.4UTI改善了IRI后的肝组织代谢与PH组相比，PHIR和UTI组再灌注24、48 h的ATP含量都明显下降(P<0.05)，但UTI组ATP含量较PHIR组明显升高(P<0.05)。PHIR组和UTI组48 h ADP和AMP含量都明显高于PH组(P<0.05)。UTI组的能量负荷优于PHIR组(P<0.05，表4)。

图1三组术后24、48h肝组织PCNA的表达情况

Fig.1 The expression of PCNA in hepatic issues in the three groups at 24 h and 48 h after operation (PCNA, ×200)

A1、A2：PH组；B1、B2：PHIR组；C1、C2：UTI组。

表4各组24、48h肝组织ATP、ADP和AMP含量和能量负荷的比较

Tab.4 ATP, ADP and AMP contents and energy charge in hepatic tissues of each group at 24 h and 48 h after reperfusion

n=8)

与PH组比较，*P<0.05；与PHIR组比较，#P<0.05。

3 讨 论

肝脏具有强大的再生功能，但当伴有肝组织部分缺失时，IRI可引发肝再生能力下降,诱发术后肝功能衰竭[1,5]。本研究结果显示PHIR组血清ALT和AST，肝细胞凋亡指数都明显高于PH组，表明本研究中PHIR组出现明显的肝功能损害，说明模型制备是成功的；而PHIR组残肝组织的PCNA表达和肝再生度较PH组明显降低，说明IRI确实抑制了肝大部切除术后残肝再生功能，这与以往的研究结果相同[6]。

UTI是由143个氨基酸组成的酸性糖蛋白，含有由5个氨基酸连接的Kunitz型结构域，能抑制α-糜蛋白酶、胰蛋白酶等多种蛋白酶。研究表明UTI能通过抑制中性粒细胞的活化和脱颗粒而减轻IRI[7]。本研究结果显示UTI预处理后，UTI组的血清ALT和AST，肝细胞凋亡指数都明显低于PHIR组，而再灌注后24h和48h的PCNA阳性表达率和肝再生度明显高于PHIR组，表明UTI不但能减轻肝大部切除术合并缺血再灌注的肝IRI，也能明显缓解IRI对肝再生的抑制作用。

肝再生过程受众多细胞因子的调控，我们发现UTI可能通过TNF-α/IL-6/STAT- 3信号通路调节肝再生[3]。而肝再生也是一个耗能过程，DNA合成、细胞周期转换和有丝分裂等过程都需要大量能量。ATP是细胞内主要的能量物质，细胞进行DNA复制和细胞分裂增殖必须依赖足够数量的ATP。观察表明肝切除后肝组织释放ATP调节肝脏再生[8]。肝硬化的患者,部分肝切除后，肝细胞存在能量代谢失衡，ATP 水平显著降低，导致肝再生状态显著地受到抑制,易诱发肝功能衰竭。线粒体是细胞内生成ATP的主要场所，IRI会造成线粒体损伤，使线粒体产生ATP的能力发生障碍[9]。我们也发现IRI会促进肝线粒体膜通透性转换孔开放，破坏正常的线粒体膜电位，而正常的线粒体膜电位是合成ATP的基础[10]。UTI通过其膜稳定作用，对肝IRI时的线粒体损伤具有保护作用[11]。TAIE等[12]发现UTI对肾IRI的保护作用与促进细胞内ATP和Na浓度恢复，维护细胞内酸碱水平，保护线粒体结构有关。本研究证实UTI预处理后，再灌注24 h和48 h的肝组织ATP含量和能量负荷水平明显高于PHIR组，表明UTI对肝再生的促进作用与维持能量代谢，增高肝细胞内ATP水平有关，其原因可能与UTI减轻了再灌注后线粒体损伤有关。

综上所述，本研究提示UTI对肝大部切除合并IRI具有保护作用，UTI预处理能促进残肝再生，其机制与促进肝组织的能量代谢，增加ATP水平有关。

参考文献：

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