STAT3及p-STAT3在肝癌中的表达及其与 肝癌临床病理特征的关系

宋 涛，杨 雪，郭 成，姚英民，杨 威，丁飞虎，刘青光

(西安交通大学医学院第一附属医院肝胆外科，陕西西安 710061)

信号传导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)是研究干扰素调节基因时发现的，随后不断发现众多酪氨酸激酶作用于不同种类的STAT蛋白。在哺乳动物细胞中，STAT家族发现7个亚型，分别是：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6。其中STAT3被认为是一种癌基因，是多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚点，在多种肿瘤中呈现异常表达活化[1]，STAT3及其活化产物表达同肿瘤分级和患者预后存在关联，在肝癌中是否也存在类似现象尚不完全确定。

1 材料与方法

1.1组织标本组织标本均来自2008～2010年西安交通大学医学院第一附属医院手术患者，均合并有乙型病毒性肝炎肝硬化，经术后病理证实为肝细胞肝癌，共计73例，其中男性61例，女性12例，年龄28～72岁，中位年龄50.5岁，取非坏死区肝癌组织(肝癌组织)及距肿瘤边缘2 cm肝硬化组织(癌旁组织)约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。所有组织均为手术切除后获取的新鲜标本，组织标本获取后立即转移至液氮及40 g/L多聚甲醛固定，经HE染色证实剔除标本内包含坏死组织样本。

1.2主要试剂PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，鼠抗人STAT3单克隆抗体和鼠抗人p-STAT3单克隆抗体购于Santa Cruz Inc(sc-81385, sc-8059)，Elivision二步法二抗试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3RT-PCR检测肝癌组织及癌旁组织STAT3的转录参照FASTAGEN-RNAfast200试剂盒提取组织总RNA，逆转录条件为：37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。扩增反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增30个循环；最后72 ℃延伸5 min，PCR扩增产物取5 μL，20 g/L琼脂糖凝胶电泳，以β-actin基因为内参照。STAT3上游引物：5′-GTCAGATGCCAAATGC-3′，下游引物：5′-TGATGTACCCTTCGTTC-3′。β-actin上游引物：5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物：5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。以senesiAnsys凝胶定量分析软件进行凝胶扩增产物灰度定量分析。

1.4免疫组化检测肝癌组织及癌旁组织STAT3、p-STAT3表达采用免疫组织化学Elivision二步法，按照试剂盒操作说明书进行操作：60 ℃烘烤切片2 h，石蜡切片脱蜡水化，90 ℃微波抗原热修复2 min，依次滴加30 mL/L H2O2室温下灭活内源性过氧化物酶10 min；STAT3和p-STAT3鼠抗人一抗(分别1∶100；1∶150稀释)，4 ℃保存16 h；聚合物增强剂室温孵育20 min；酶标抗鼠/兔聚合物室温孵育25 min；DAB显色。阴性对照组中，以PBS液代替一抗。

1.5免疫组织化学法阳性结果判定密封组织片号，由我院病理科2位病理医师在显微镜下观察组织切片阳性染色情况并进行评分。镜下选取每一组织点的中心部，染色结果判定参照Mattern方法进行判定。阳性染色深度：未见染色为0，轻度染色(浅黄色)为1，中度染色(棕黄色)为2，深度染色(棕褐色)为3；阳性细胞百分比：未见染色为0，染色细胞<25%为1，25%～50%为2，>50%为3。两方面得分相加，0～2分判为阴性表达，>2分判为阳性表达，随机选择10个高倍视野，记数1 000个细胞。记录肝癌组织和癌旁组织p-STAT3阳性表达率及各样本临床资料，病理学特征(年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤计数、病理分级、TNM分期、是否存在包膜、门静脉系统侵犯、血清AFP浓度、HBsAg阳性率)。

2 结 果

2.1STAT3在肝癌组织和癌旁组织中的mRNA水平STAT3逆转录扩增产物为368 bp，内参β-actin扩增产物大小为197 bp，在肝癌组织和癌旁组织中均发现存在STAT3转录(图1)，但是肝癌组织的STAT3mRNA扩增产物电泳条带灰度明显高于对应癌旁组织，STAT3基因的PCR产物量/β-actin的比值经t检验，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图1肝癌组织(Ca)及对应癌旁组织(N)中STAT3mRNA的表达

Fig.1 STAT3 mRNA expression in hepatic carcinoma tissues (Ca) and paracancerous tissues (N)

2.2免疫组化检测结果73例肝细胞肝癌组织和癌旁组织中未出现组织自溶现象，标本保存良好。STAT3蛋白阳性染色定位于肿瘤细胞胞质及核周，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，弥漫或局灶性分布，而肿瘤间质组织中未见STAT3蛋白阳性染色；癌旁组织中STAT3阳性表达率26.0%(19/73)，而肝细胞肝癌组织中阳性表达率75.3%(65/73)，癌旁组织中STAT3表达弱于肝癌组织(图2)，阳性表达率组间差异具有统计学意义(P<0.01)。p-STAT3蛋白阳性染色定位于肿瘤细胞胞核内，呈棕褐色颗粒状。癌旁组织中p-STAT3表达同样弱于肝癌组织，阳性表达率组间差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

图2STAT3和p-STAT3在肝癌组织和癌旁组织的表达

Fig.2 Expression of STAT3 and p-STAT3 in hepatic carcinoma tissues and paracancerous tissues (×400)

A：STAT3在肝癌组织中呈阳性表达；B：STAT3在癌旁肝组织中呈阴性表达；C：p-STAT3在肝癌组织中呈阳性表达；D：p-STAT3在癌旁肝组织中呈阴性表达。

表1STAT3和p-STAT3在肝癌组织及癌旁组织中阳性表达

Tab.1 Positive expression of STAT3 and p-STAT3 in hepatic carcinoma tissues and paracancerous tissues

[n(%)]

与癌旁组织比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3p-STAT3表达同肝癌病理特征关系73例肝癌组织中p-STAT3表达阴性和阳性组间肿瘤大小、组织病理分化、TNM分期、门静脉系统侵犯比率的差异有统计学意义，而患者年龄、性别、肿瘤个数、是否存在假胞膜、血清AFP浓度和HBsAg阳性率组间比较差异无统计学意义(表2)。

3 讨 论

STAT3是IL-6/JAK2/STAT3信号通路的关键调控基因，参与调节众多基因转录，影响细胞增殖侵袭活性[1]，研究证实几乎在人类主要肿瘤中均存在STAT3异常表达，在多种肿瘤中STAT3阳性表达同肿瘤病理分级及不良预后相关[2-5]。部分肝癌细胞株内STAT3转录水平异常[6]；建立肝癌大鼠模型中也发现肝癌细胞内存在STAT3表达和激活[7]。但是对于人肝癌组织中STAT3表达状况以及STAT3表达同肝癌病理特征是否相关存在不同意见[8]，其在肝癌发生发展中的作用尚不完全明确。

我国肝癌患者多数伴有乙型肝炎病毒感染及肝硬化，其血清IL-6水平高于正常人群[9]，存在使受损肝细胞和肝癌细胞内IL-6/JAK2/STAT3通路持续激活的始动因素，而且在肝脏细胞和肝脏肿瘤细胞表面发现IL-6受体gp130存在[10]，存在激活IL-6/JAK2/STAT3信号通路的物质基础。本实验通过肝癌组织和癌旁肝硬化组织内STAT3 mRNA对比，发现癌旁肝硬化组织虽然存在STAT3基因转录，但是明显低于肝癌组织，说明在肝硬化组织受损细胞向肝细胞肝癌转化中，存在STAT3转录异常升高。通过免疫组织化学证实STAT3蛋白在肝癌组织内表达强度以及阳性表达率均高于癌旁肝硬化组织，而且p-STAT3蛋白也有类似改变，说明在同样存在炎性因子高表达的微环境下，癌旁肝硬化组织STAT3蛋白不同于肝癌组织中的表达升高，STAT3的异常转录表达及活化可能是受损细胞向肝癌细胞转化的中间事件，STAT3在肝硬化组织癌变过程中可能扮演了重要角色。

表2p-STAT3表达与肝癌临床病理特征关系

Tab.2 Correlation between p-STAT3 expression and clinicopathological characteristics in hepatic carcinoma

病理特征例数(n)表达水平阳性表达(n=38)阴性表达(n=35)P值年龄7349.92±9.3951.34 ±7.550.714性别0.633 男613130 女1275肿瘤直径0.029* <5cm321220 ≥5cm412615肿瘤个数0.135 单个572839 多个16106组织病理分化0.009 良(I)808 中(Ⅱ,Ⅲ)512724 差(Ⅳ)14113TNM分期0.028 Ⅰ～Ⅱ301119 Ⅲ～Ⅳ432716包膜形成0.153 无462125 有271710门静脉侵犯0.001 无421527 有31238AFP(ng/mL)0.453 <400472621 ≥400261214HBsAg0.294 阳性583226 阴性1569

IL-6/JAK2/STAT3通路持续激活的最终结果是提高细胞内p-STAT3蛋白表达量，具有生物学活性的p-STAT3蛋白表达异常才可能影响诸如VEGF，survivin等影响细胞增殖侵袭的功能基因转录水平，进而表现为p-STAT3表达同患者临床病理特征相关。我们发现肝癌组织中p-STAT3表达水平明显高于癌旁肝硬化组织，通过对比肝癌组织中p-STAT3阳性表达组和阴性表达组患者的临床特征，发现两组患者在肿瘤大小、组织病理分化、TNM分期、门静脉系统侵犯存在统计学差异，p-STAT3阳性表达组患者肿瘤直径大于5 cm者更多，组织病理更趋向低分化，TNM分期更晚，门静脉系统侵犯率高，以上现象反映出p-STAT3阳性表达肝癌细胞更具增殖侵袭能力，恶性程度更高，虽然未进一步对2组肝癌患者进行生存分析，但是既往众多文献证明肿瘤直径大于5 cm，组织病理分化差，TNM分期晚，门静脉系统侵犯均是患者预后不佳的标志性事件[11-12]，而p-STAT3蛋白表达均与以上因素正相关，因此推断p-STAT3有可能成为提示肝癌患者预后的指标之一。

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