多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因adeB的研究

孙静娜，刘青松，刘泽世，赵 帅，王国欣，张 征*

（1.河北医科大学第一医院检验科，河北 石家庄 050031；2.河北省容城县医院普外科，河北 容城 071700）

多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌外排泵基因adeB的研究

孙静娜1，刘青松2，刘泽世1，赵 帅1，王国欣1，张 征1*

（1.河北医科大学第一医院检验科，河北 石家庄 050031；2.河北省容城县医院普外科，河北 容城 071700）

目的 观察多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌主动外排泵在耐药方面的作用和外排泵基因表达情况。方法 通过比较加入羰基氰氯苯（carbonyl cyanldem-chlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制剂前后，96株鲍曼不动杆菌对四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟4种药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的变化，筛选出34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌。用聚合酶链反应扩增对34株菌进行外排泵蛋白基因adeB的检测和分析，并测序。结果 最终筛选出对4种抗生素MIC值均降低4倍及以上菌34株（35.42%），34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌检测到adeB基因33株，检出阳性率为97.06%。对33株鲍曼不动杆菌的外排泵基因adeB进行测序，经比对所测序列与基因库（Genebank）中序列同源性为100.00%。结论 泵抑制剂CCCP对于逆转鲍曼不动杆菌对四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟4种抗菌药物的耐药性起到重要作用，主动外排泵基因是鲍曼不动杆菌发生多重耐药的重要因素。

鲍氏不动杆菌；抗药性，多药；基因表达

鲍曼不动杆菌在住院患者尤其是有免疫缺陷或重症监护病房患者尤为常见，75%住院患者可定植鲍曼不动杆菌，在医院内则很容易通过交叉感染暴发流行［1］。耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行，也已成为我国院内感染最重要的病原菌之一［2］。尤其是多重耐药及泛耐药鲍曼不动杆菌在住院患者体内的出现，与不合理使用抗菌药物增加细菌产生耐药有关［3］。其中，多药外排系统是鲍曼不动杆菌多药耐药的一个重要原因。特别是AdeABC外排泵参与了鲍曼不动杆菌对氨基糖甙类药物、β-内酰胺类药物、氯霉素、红霉素和四环素的耐药。本研究对泛耐药鲍曼不动杆菌外排泵系统进行基因检测并测序，探讨鲍曼不动杆菌主动外排泵系统在耐药方面的作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源：本实验所用菌株来自 2012—2013

年河北医科大学第一医院72株多重耐药鲍曼不动杆菌及24株泛耐药鲍曼不动杆菌。取纯培养细菌增菌液lmL与0.5mL 50%甘油肉汤混匀，－70℃冰箱保存并备用。

1.2 仪器：Maxwell-16核酸提取仪（美国Promega

公司），Mini-4K／6K微型离心机（珠海黑马医学仪器有限公司），AB 9700PCR扩增仪（美国 AB公司），DYY-12电泳仪（北京六一仪器厂），VilBer LouRMAT凝胶成像系统 （法国 VILBER LOURMAT公司），SIGMA 3-18K台式冷冻离心机（德国Sigma公司）。

1.3 试剂：羰基氰氯苯腙（carbonyl cyanldemchlorophenyl hydrazone，CCCP）泵抑制剂，泵抑制剂溶解试剂二甲亚砜购于河北博世林公司；抗菌药物四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟均购于英国OXID公司；引物adeB由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；DNA提取试剂盒MaxwellⓇ16 Cell LEV DNA Purification Kit购自 Promega公司；聚合酶链反应 （polymerase chain reaction，

PCR）扩增试剂 GoTaqⓇGreen Master Mix和

GoTaqⓇColorless Master Mix购自美国 Promega公司；DNA染色剂 Goldview和 DNA Ladder Marker购自北京赛百盛公司；琼脂糖X-gal购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 加入外排泵抑制剂前后抗菌药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）：采用微量肉汤稀释法测定加入工作浓度的泵抑制剂CCCP前后，4种抗菌药物四环素、庆大霉素、诺氟沙星、头孢噻肟对96株鲍曼不动杆菌的MIC，同时加入泵抑制剂和空白孔作为生长对照。

1.4.2 外排泵表型阳性鲍曼不动杆菌的判定：参考Sylvia Valdezate方法，比较应用CCCP泵抑制剂前后96株鲍曼不动杆菌对抗菌药物 MIC值的变化，以加入泵抑制剂后MIC值较不加泵抑制剂降低4倍或以上作为外排泵表型阳性的判定标准。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB：采用PCR技术检测外排泵蛋白基因adeB。

1.4.3.1 adeB基因PCR引物的设计：根据基因库（GenBanK）中已发布的各型基因序列和参考文献［4］自行设计基因引物，扩增产物长度约 541bp，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物A，5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′（AF-370885）；引物B，5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′（AF370885）。

1.4.3.2 电泳：缓冲液0.5×TBE（电泳液配制10× TBE，108gTris碱、7.44g Na2EDTA·2H2O和55g硼酸，加超纯水至 1L，使用时用水稀释为0.5× TBE），电压100V，上样标本量8μL，DNA相对分子质量Maker（100bp）8μL，电泳50min；置于全自动凝胶图像成像仪上观察结果并照相，出现与目的基因片段分子相当的条带判为阳性。

1.4.4 adeB基因测序：把阳性DNA条带所在的凝胶切下，将PCR扩增产物和切下的含阳性DNA的凝胶送上海生工生物工程技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。用DNA Star软件中的Editseq和Megalign分析测得的核苷酸序列，取双向测序结果一致的序列作为参比序列，应用NCBI中BLAST程序比对序列。

2 结 果

2.1 4种抗菌药加入CCCP泵抑制剂前后MIC变化情况：在加入CCCP泵抑制剂前后，96株多重耐药株对四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟的MIC范围分别由32～128、64～128、16～128、64～128mg／L变为8～64、1～128、1～64、8～128mg／L。 见表1。

表1 4种抗菌药加入CCCP抑制剂前后MIC变化结果Table 1 The influence four antimicrobials of on MIC scope before and after pump inhibitors （mg／L）

2.2 筛选出外排泵表型阳性菌情况：96株多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌株筛选出外排泵表型阳性菌34株。在加入泵抑制剂CCCP后四环素的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者37株，降低2倍者 8株，没有变化者 51株；诺氟沙星的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者41株，降低 2倍者 12株，没有变化者 43株；庆大霉素的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者 53株，降低2倍者9株，没有变化者34株；头孢噻肟的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者 39株，降低2倍者 6株，没有变化者51株。其中，筛选出34株鲍曼不动杆菌在加入CCCP泵抑制剂后4种抗生素MIC值均降低4倍。见表2。

表2 多重耐药菌和泛耐药鲍曼不动杆菌外排泵表型Table 2 The efflux phenotype positive of multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii （n ）

2.3 adeB基因的检出情况：34株鲍曼不动杆菌检测到adeB基因的有33株，检出率为97.06%。adeB基因扩增电泳结果见图1。

图1 adeB基因扩增电泳结果M：DNA相对分子质量（100、250、500、750、1 000、2 000 bp）Figure 1 Electrophoresis of PCR product of adeB geneM：DNA marker（100，250，500，750，1 000，2 000 bp）

2.4 adeB基因测序结果：取正反向双向测序结果一致的序列作为参比序列，应用NCBI中BLAST程序比对序列，经比对所测序列与 Genebank中序列同源性均为100.00%，未发现基因变异现象。adeB基因测序结果见图2。

图2 adeB基因测序结果Figure 2 The sequence of the adeB genes

3 讨 论

鲍曼不动杆菌是引起院内感染的最为重要的机会致病菌。鲍曼不动杆菌通过其酶机制、外排泵、抗渗性等极容易形成耐药菌株。其中外排机制是将抗菌药物及其复合物由生物膜内排至体外环境，其在细菌耐药，尤其是多重耐药中发挥重要作用［5］。主动外排泵是由菌体细胞膜表面蛋白组成的，可以将进入细菌体内的药物排出到细胞外，外排泵的过度表达都可以引起鲍曼不动杆菌耐药迅速增加［6］。AdeABC外排泵系统是引起鲍曼不动杆菌多重耐药的重要因素。主动外排泵的过度表达引起介导了部分菌株对美罗培南的耐药，而亚胺培南的耐药性可能与外排泵机制无关［7］。多药及毒性化合物外排家族的过度表达引起喹诺酮类、庆大霉素、卡那霉素、红霉素、氯霉素敏感性的降低［8］。

本实验选取了四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟4种抗菌药物作为外排底物；选取了CCCP泵抑制剂为筛选条件，CCCP分子在解离状态下，可以在磷脂膜两侧自由扩散，而质子的传递破坏跨膜电化学梯度，因此CCCP是一种很强的解偶联剂，可以阻断菌体表面蛋白能量的供应，使外排泵无法正常工作，药物不被外排而蓄积于菌体内，从而提高鲍曼不动杆菌对药物的敏感性。本研究结果表明，四环素、诺氟沙星、庆大霉素、头孢噻肟加入CCCP泵抑制剂前后 MIC范围分别由 32～128、64～128、16～128、64～128mg／L变为8～64、1～128、1～64、8～128mg／L；四环素的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者 37株，降低 2倍者 8株，没有变化者51株；诺氟沙星的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者41株，降低2倍者12株，没有变化者43株；庆大霉素的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性者 53株，降低2倍者9株，没有变化者34株；头孢噻肟的药敏结果中，MIC值降低4倍及以上外排泵表型阳性的共有 39株，降低 2倍者 6株，没有变化者 51株。其中，筛选出34株鲍曼不动杆菌在加入CCCP泵抑制剂后4种抗生素MIC值均降低4倍。筛选出34例可能由于外排泵的存在而产生耐药的鲍曼不动杆菌，说明CCCP外排泵抑制剂对逆转鲍曼不动杆菌耐药行之有效。

本研究进一步对34株外排泵表型阳性的鲍曼不动杆菌进行AdeABC外排泵的跨膜组件AdeB基因测定，检测到 adeB基因 33株，检出阳性率为97.06%。取正反向双向测序结果一致的序列作为参比序列，应用NCBI中BLAST程序比对序列，经比对所测序列与 Genebank中序列同源性均为100.00%，未发现基因变异现象。表明AdeABC外排泵机制在鲍曼不动杆菌对抗菌药物敏感性方面的作用尤其重要，含有adeB基底泵的重组衍生体相对于不含有的菌株抗菌素的敏感性降低。与王同慧等［9］认为外排泵机制在鲍曼不动杆菌多重耐药中具有重要作用结论一致。此外，结构基因的失活尤其是编码转录蛋白的adeB，外排泵活性的增强以及不同的外排泵之间相互作用仍有待研究。

本研究为使用抗生素作用于多重耐药鲍曼不动杆菌的靶位提供了实验依据，也为临床提高抗生素使用效率和研制开发新的抗菌药物提供了理论依据。

［1］吕吉云，曲芬.多重耐药微生物及防治对策［M］.北京：人民军医出版社，2011：16－17.

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［3］陈炎添，熊燕，苏雪棠，等.呼吸重症监护病房多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因检测及耐药性分析［J］.临床荟萃，2012，27（19）：1684－1686，1690.

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（本文编辑：赵丽洁）

RESEARCH ABOUT EFFLUX PUMP GENE adeB IN MULTIDRUG RESISTANCE AND PANDRUG RESISTANTACINETOBACTER BAUMANNII

SUN Jingna1，LIU Qingsong2，LIU Zeshi1，ZHAO Shuai1，WANG Guoxin1，ZHANG Zheng1*
（1.Clinical Laboratory，the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050031，China；2.Department of General Surgery，the Hospital of Rongcheng County，Hebei Province，Rongcheng071700，China）

ObjectiveTo investigate efflux pump drug-resistance and gene expression in multidrug resistant and pandrug resistantAcinetobacter baumannii.MethodsThe multidrug resistantAcinetobacter baumanniiefflux pump phenotypes were detected by joining carbonyl cyanidem-chloropheny hydrazone（CCCP）pump inhibitors，the minimum inhibitory concentration（MIC）variation was observed in 96 strains ofAcinetobacter baumanniiresistant to tetracycline，norfloxacin，gentamicin，cefotaxime，34 strainsofefflux phenotypepositiveAcinetobacter baumanniiwere screened out.The efflux pump protein gene adeB in 34Acinetobacter baumanniiwere detected and sequenced with the polymerase chain reaction amplification.ResultsThe initial selection involoed 34 strains（35.42%）whose MIC reduced by 4 times and above.In 34 stains of efflux pump phenotype positiveAcinetobacter baumannii，33 strains were detected adeB gene，the positive rate was 97.06%.When the 33 strainsAacinetobacter baumanniiadeB efflux pump gene were sequenced，the sequence homology was 100.00%compared in Genebank.ConclusionPump inhibitor CCCP plays an important role in the reversal ofAcinetobacter baumanniiresistant totetracycline，norfloxacin，gentamicin and cefotaxime，active efflux pump genes play an important role in multidrug resistantAcinetobacter baumannii.

acinetobacter baumannii；drug resistance，multiple；gene expression

R378.79

A

1007-3205（2014）10-1166-04

2014－04－25；

2014－06－12

孙静娜（1976－），女，河北保定人，河北医科大学第一医院副主任检验师，医学硕士，从事微生物学检验研究。

*通讯作者。E-mail：zhangzheng197101＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.016