卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP的建立及其与凋亡途径蛋白的关系

申 薇，梁冰锋，李秀荣，秦秀红，程建新

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011；2.河北女子职业技术学院护理系，河北 石家庄 050091）

卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP的建立及其与凋亡途径蛋白的关系

申 薇1，梁冰锋2*，李秀荣1，秦秀红2，程建新1

（1.河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011；2.河北女子职业技术学院护理系，河北 石家庄 050091）

目的 通过顺铂（cisplatin，DDP）诱导卵巢癌细胞珠SKOV3建立耐药细胞株SKOV3／DDP，并研究其与凋亡途径蛋白的关系。方法 应用倒置显微镜观察 DDP对细胞形态的影响，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测DDP对SKOV3和SKOV3／DDP细胞的增殖抑制情况，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡率以及细胞中X链锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteine-aspartic acid protease-3，Caspase-3）、B细胞淋巴瘤／白血病 2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）的表达情况。结果 MTT法检测发现DDP作用后，SKOV3／DDP细胞的增殖抑制率较SKOV3细胞显著降低（P＜0.01），且存在着浓度和时间依赖效应（P＜0.01）。由半数抑制浓度（50% concentration of inhibition，IC50）比较得 SKOV3／DDP细胞 24、48、72h耐药指数（resistance index，RI）分别为2.434、2.950、3.780。FCM检测表明，DDP作用后，SKOV3／DDP凋亡率显著低于 SKOV3细胞（P＜0.01）。与SKOV3细胞相比，SKOV3／DDP细胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白高表达，Caspase-3蛋白低表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 成功建立卵巢癌耐药细胞株 SKOV3／DDP，其耐药机制可能与 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的异常表达有关，表明这些蛋白参与了卵巢癌DDP耐药的形成。

卵巢肿瘤；顺铂；抗药性，肿瘤

严重威胁着女性的生命健康，该疾病5年生存率约为45%，甚至低于25%～30%［1－2］。铂类药物如顺铂（cisplatin，DDP）是目前卵巢癌治疗的主要药物之一，由于肿瘤的多药耐药性使得DDP在卵巢癌治疗中并没有实质性的进展，严重影响了该药物在临床上的应用效果［3］。耐药的相关机制很多，其中耐药蛋白的异常表达是重要因素之一，X链锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein，

XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（cysteineaspartic acid protease-3，Caspase-3）、B细胞淋巴瘤／白血病2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和生存素（Survivin）是细胞凋亡途径的重要调节因子，研究发现4种蛋白在多种恶性肿瘤细胞中表达异常，并且参与了肿瘤多药耐药性的产生，在恶性肿瘤的发生发展中起了至关重要的作用［4］。因此，建立卵巢癌DDP耐药细胞株SKOV3／DDP，分析细胞凋亡通路耐药相关蛋白在卵巢癌DDP耐药细胞中的表达，研究耐药机制，对提高抗肿瘤药物治疗的靶向性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株：人卵巢癌SKOV3细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。将人卵巢癌SKOV3细胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，在培养瓶内单层传代培养，37℃、5%CO2培养箱内孵育。

1.1.2 试剂和仪器：注射用DDP购自山东齐鲁制药厂，胰蛋白酶、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液购自美国Sigma公司，PBS、RPMI-1640培养液购自美国 Gibco公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自天津化学试剂厂，胎牛血清购自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自洛阳华美生物工程公司，兔抗人 Bcl-2和 XIAP多克隆抗体购自bioworld公司，鼠抗人 Caspase-3和 Survivin单克隆抗体购自北京中杉金桥试剂有限公司。流式细胞仪（Epics-XLⅡ型）购自美国 Beckman Coulter公司；酶标仪（HT2-125500型）购自郑州博赛生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 耐药细胞株 SKOV3／DDP的诱导：采用DDP持续接触浓度递增的方法对SKOV3细胞株进行诱导，取对数生长期SKOV3细胞，于含有0.02 mg／L DDP的培养基中培养，逐步提高DDP的诱导浓度，直到细胞能在含0.2mg／L DDP的培养基中稳定生长，历时8个月，将其命名为SKOV3／DDP细胞。

1.2.2 倒置显微镜观察细胞形态：取对数生长期的SKOV3和SKOV3／DDP细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。

1.2.3 药敏试验：采用MTT法检测SKOV3细胞、SKOV3／DDP细胞对DDP的敏感性。SKOV3／DDP细胞在不含DDP的RPMI-1640培养液中培养2周后备用，取对数生长期的SKOV3、SKOV3／DDP细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，用含12%胎牛血清的 RPMI-1640培养液制成单细胞悬液，以8.0×104／孔接种于96孔培养板，每孔 100μL，每组设6个复孔。24h细胞贴壁后，分别加入不同浓度DDP（1、2、4、8、16mg／L），0mg／L DDP组加入生理盐水。置 37℃、5%CO2条件下分别孵育 24、48、72h后，每孔加入MTT溶液（5g／L）20μL，置37℃、5%CO 条件下继续孵育4h，终止培养，倾去培养液。每孔加入 150μL DMSO，振荡 10min。选择490nm波长，以空白孔调零，在酶标仪上测定各孔光吸收值A490，计算细胞的增殖抑制率和耐药指数（resistance index，RI）。增殖抑制率＝1－实验组A490值／对照组A490值；RI＝耐药细胞半数抑制浓度（50%concentration of inhibition，IC50）／亲本细胞IC50。

1.2.4 流式细胞术检测SKOV3和SKOV3／DDP细胞中蛋白的表达：取生长状态良好，处于对数生长期的SKOV3和SKOV3／DDP细胞，冷PBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶消化，4℃预冷的PBS洗2遍细胞后，离心弃去上清液，调整细胞浓度为1×107／mL，向细胞悬液中加入 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin抗体，避光静置 30min，加入二抗工作液100μL，对照组只加二抗。室温静置30min，上机检测死亡受体XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivinn表达量，实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测SKOV3和SKOV3／DDP细胞凋亡：取对数生长期的SKOV3和SKOV3／DDP细胞4×105／孔接种于6孔板中，在37℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁后，设置一个加生理盐水的空白对照组，其余为不同浓度 0、2、4、8mg／L DDP组，每组设3个复孔，作用48h后收集细胞，并调整细胞数为 1×107／mL，取 100μL细胞悬液向其中加入DNA染液（PI 50mg／L，RNA酶10mg／L及1%Triton-X100）1mL，在4℃冰箱中染色30min，上机检测凋亡，实验重复3次。

1.3 统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，分别采用单因素方差分析、q检验和t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP的培养：通过8个月的培养，成功获得了SKOV3／DDP耐药细胞株。倒置显微镜下观察，SKOV3、SKOV3／DDP细胞均贴壁生长，上皮细胞样复层生长的SKOV3细胞呈梭形，细胞数目多，透明，排列紧密，细胞圆亮饱满，细胞间边界清楚。SKOV3／DDP细胞较SKOV3细胞大，呈多角形，神经元细胞样生长，体积膨胀，核仁多，细胞质可见颗粒状囊泡，边界模糊，折光性差。

2.2 DDP作用于SKOV3和SKOV3／DDP的增殖抑制率：随着DDP浓度增高，SKOV3、SKOV3／DDP细胞的增殖抑制率呈上升趋势，同一细胞不同剂量组之间比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；同一时间组比较，SKOV3／DDP细胞的增殖抑制率低于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

DDP作用SKOV3、SKOV3／DDP细胞24、48、72h，SKOV3细胞的 IC50值分别为11.193、5.940、3.031，SKOV3／DDP细胞分别为27.241、17.522、11.456，由 IC50比较得 SKOV3／DDP细胞 24、48、72h RI分别为2.434、2.950、3.780，随着时间的推移RI逐渐增加。

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP细胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

表1 DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP细胞24、48、72h的增殖抑制率Table 1 Proliferative inhibition rate of SKOV3 and SKOV3／DDP cells after DDP treatment for 24，48 and 72h（n＝6，，%）

DDP（mg／L） SKOV3 24h 48h 72h F P 1 13.332±1.211 19.558±1.381 26.774±1.981 111.614 0.000 2 20.848±2.232 29.763±1.228 40.762±2.220 156.861 0.000 4 31.110±2.887 44.884±1.402 65.781±2.852 297.568 0.000 8 42.584±1.679 66.857±1.342 78.849±1.731 806.738 0.000 16 68.209±2.318 83.886±1.961 92.128±3.889 109.167 0.000 F 602.289 1 897.398 617.668 0.000 0.000 0.000 DDP（mg／L） SKOV3／DDP 24h 48h 72h P F P 1 7.234±0.891 10.453±1.317 15.451±1.229 76.404 0.000 2 12.671±1.112 17.891±1.011 23.562±2.548 61.029 0.000 4 19.776±1.881 25.770±1.563 33.879±3.211 55.349 0.000 8 27.219±2.228 34.463±1.451 42.861±2.987 64.776 0.000 16 42.113±2.149 52.227±2.327 67.887±4.223 108.928 0.000 F 367.104 615.364 273.358 P 0.000 0.000 0.000

2.3 SKOV3、SKOV3／DDP细胞中XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的表达：SKOV3／DDP细胞XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表达量显著高于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P＜0.01）；SKOV3／DDP细胞中Caspase-3蛋白的表达量低于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP细胞中的表达Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

表2 XIAP、Caspase-3、Bc-I2和Survivin蛋白在SKOV3和SKOV3／DDP细胞中的表达Table 2 Expression of XIAP，Caspase-3，Bc-l2 and Survivin proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells（n＝6，）

XIAP：X-linked inhibitor-of-apoptosis protein；Caspase-3：cysteine-aspartic acid protease-3；Bcl-2：B cell lymphoma／lewkmia-2

Proteins XIAP Caspase-3 Bcl-2 Survivin SKOV3 251.712±7.501 366.812±16.139 328.314±17.302 240.359±10.456 SKOV3／DDP 296.528±11.565 299.093±21.804 399.657±15.037 297.946±15.566 t 7.964 6.115 7.624 7.522 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 DDP对SKOV3、SKOV3／DDP细胞凋亡的影响：DDP作用SKOV3和SKOV3／DDP细胞48h后，随DDP浓度增高，细胞凋亡率显著增加，且两两比较差异有统计学意义（P＜0.01）；2、4、8mg／L DDP组SKOV3／DDP细胞凋亡率低于SKOV3细胞，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3 DDP对SKOV3／DDP和SKOV3细胞凋亡率的影响Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

表3 DDP对SKOV3／DDP和SKOV3细胞凋亡率的影响Table 3 Effect of DDP on apoptosis of SKOV3／DDP and SKOV3 cells（n＝6，，%）

*P＜0.01vs0mg／L ＃P＜0.01vs2mg／L △P＜0.01vs4mg／L byqtest DDP：cisplatin

Proteins DDP 0mg／L 2mg／L 4mg／L 8mg／L F P SKOV3 1.319±0.96 12.531±1.12*18.867±1.76*＃28.673±3.53*＃△178.043 0.000 SKOV3／DDP 1.669±0.68 6.908±0.56*8.121±0.89*＃19.133±1.12*＃△456.692 0.000 t 0.729 10.999 13.316 6.310 P 0.483 0.000 0.000 0.000

3 讨 论

本研究利用药物浓度逐步递增的方法，体外诱导培养了卵巢癌DDP耐药细胞株，即SKOV3／DDP细胞，与SKOV3细胞相比，其细胞体积和形态均发生显著变化，与李宏等［5］的研究结果类似。DDP作用SKOV3／DDP细胞和SKOV3细胞后，SKOV3／DDP细胞生长抑制率显著低于SKOV3细胞，由IC50比较得SKOV3／DDP细胞24、48、72h RI分别为2.434、2.950、3.780，说明SKOV3／DDP细胞产生DDP耐药。

XIAP蛋白是凋亡抑制蛋白家族成员，在免疫逃避、抗细胞凋亡等方面发挥了重要作用，许多恶性肿瘤中 XIAP高表达，且与不良预后具有相关性［6－7］。Survivin是凋亡抑制蛋白 成员之一，Survivin在细胞有丝分裂、增殖过程中起着关键性作用，其高表达可增强XIAP的活性，使细胞肿瘤逃避凋亡和转移［8］。Caspases家族是以酶原形式存在的凋亡过程中的效应蛋白，能通过蛋白酶的水解进行细胞内信号的转导，在线粒体通路、内质网通路和死亡受体3条通路中均存在Caspase不可逆的激活，最终导致细胞凋亡，且Caspase-3是与凋亡通路最为密切的蛋白［9－10］。Bcl-2基因是细胞凋亡的重要调节基因蛋白，Bcl-2的高表达能够抑制多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡，主要通过抑制Caspase-3活性和Caspase-3底物PARP的分解达到抗凋亡的作用，Bcl-2的高表达可致肿瘤细胞耐药性的增高，是细胞发生耐药的机制之一［11－12］。本研究采用流式细胞术检测显示SKOV3／DDP细胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白表达增高，Caspase-3蛋白表达降低，说明DDP在诱导敏感SKOV3细胞产生耐药过程中，XIAP、Caspase-3、Bcl-2与Survivin均参与了卵巢癌SKOV3／DDP细胞耐药性的产生。

综上所述，本实验所诱导的耐药细胞株SKOV3／DDP产生DDP耐药，其机制可能与细胞中凋亡途径相关蛋白XIAP、Bcl-2与Survivin表达升高和 Caspase-3表达降低有关。耐药细胞株SKOV3／DDP的建立，为卵巢癌DDP耐药的进一步研究提供了理想的细胞模型。

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（本文编辑：赵丽洁）

ESTABLISHMENT OF DRUG-RESISTANT CELL LINE SKOV3／DDP FOR OVARIAN CANCER AND ITS RELATIONSHIP WITH APOPTOSIS PATHWAY PROTEINS

SHEN Wei1，LIANG Bingfeng2*，LI Xiurong1，QIN Xiuhong2，CHENG Jianxin1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Nursing Faculty，Hebei Women Vocational Technology College，Shijiazhuang050091，China）

ObjectiveTo establish drug-resistant cell line SKOV3／DDP through ovarian cancer cell line SKOV3 by induced cisplatin（DDP），and to study its relationship with the apoptosis pathway proteins.MethodsThe inverted microscope was applied to observe DDP influence on the cell morphology.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to detect proliferation inhibition rate affected by DDP on SKOV3 and SKOV3／DDP cells.Flow cytometry（FCM）was used to detect the influence of cell apoptosis and the expression of X-linked inhibitorof-apoptosis protein（XIAP），cysteine-aspartic acid protease-3（Caspase-3），B cell lymphoma／lewkmia-2（Bcl-2）and Survivin proteins.ResultsMTT assay showed that proliferation inhibition rate of SKOV3／DDP cells decreased significantly compared with SKOV3 cells after DDP influence（P＜0.01），and depended on the concentration and time（P＜0.01）.The resistance index of DDP to SKOV3／DDP and SKOV3 cells in 24h，48h and 72h were respectively 2.434，2.950 and 3.780 by comparison between 50%concentration of inhibition values.FCM revealed that the apoptosis rates of SKOV3／DDP cells to DDP decreased obviously after 48h than those of SKOV3 cells（P＜0.01）.Compared with SKOV3 cells，the expression of XIAP，Bcl-2 and Survivin proteins in SKOV3／DDP cells were higher，while the expression of Caspase-3 protein was lower，and their differences were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionDrug-resistant cell line SKOV3／DDP for ovarian cancer is successfully established and its resistance mechanism is closely related with the abnormal expression of XIAP，Caspase-3，Bcl-2 and Survivin proteins.These proteins might be involved in the drug resistance of ovarian cancer.

ovarian neoplasms；cisplatin；drug resistance，neoplasm卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，临床早期症状隐匿，不易被发现，多以浸润、转移和腹腔积液形成为特点，多数患者临床确诊时已为晚期，

R737.31

A

1007-3205（2014）10-1135-05

2014－07－03；

2014－09－02

河北省201 1年医学科学研究重点课题计划（20110477）

申薇（1980－），女，天津人，河北医科大学第四医院医师，医学博士，从事妇科肿瘤疾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.007