尼非韦罗微乳热敏原位凝胶相变性和体外释药行为

王玉柱，职瑞娜,2，兰梦宁，杨 凯，李卫华,2*，丁训诚

（1.上海市计划生育科学研究所 国家计划生育药具重点实验室，上海 200032； 2.复旦大学 上海医学院，上海200032； 3.英国马尔文仪器有限公司，上海 200233)

尼非韦罗微乳热敏原位凝胶相变性和体外释药行为

王玉柱1，职瑞娜1,2，兰梦宁1，杨 凯3，李卫华1,2*，丁训诚1

（1.上海市计划生育科学研究所 国家计划生育药具重点实验室，上海 200032； 2.复旦大学 上海医学院，上海200032； 3.英国马尔文仪器有限公司，上海 200233)

目的以尼非韦罗（nifeviroc，NFVR）为模型药物制备一种微乳-热敏原位凝胶（microemulsion thermosensitive in situ gel，ME-TISG），并对该凝胶的制剂学性质进行考察。方法 用温控（75℃）相图方法制备尼非韦罗微乳（nifeviroc microemulsion，NFVR/ME），并将其载入泊洛沙姆407（Poloxamer 407，P407）形成的凝胶中，用动态激光散射粒度仪及透射电子显微镜测定其粒径、ζ电位及形态，利用高级旋转流变仪对凝胶流变学进行研究；采用无膜溶出模型研究在频率100 r·min-1下，NFVR/ME的释放与凝胶溶蚀之间的关系。结果不同浓度NFVR/ME的平均粒径为36.30～38.25 nm，且呈圆整均一球体，ζ电位-7.15～-7.22 mV，相转变温度为29.5℃，胶凝温度为34.5℃，NFVR/ME-TISG在低温（＜25℃）时为牛顿流体，黏度很小；随着温度升高，黏弹性增大，在35～37℃表现出典型的假塑性流体特征，复数黏度随着剪切速率的升高而逐渐减小，呈现剪切变稀现象。ME中NFVR的释放率受控于凝胶的溶蚀速率，二者呈现良好的线性关系（R2=0.98），遵循零级动力学特征，这种由溶蚀控制药物释药的方式可以避免突释效应。结论 热敏原位凝胶是一种具有应用前景的新型阴道释药系统。

药剂学；尼非韦罗；微乳；热敏原位凝胶；复数黏度；相转变温度；胶凝温度；体外释药

尼非韦罗（nifeviroc, NFVR）是我国具有自主知识产权的抗艾滋病药物[1]，药理研究显示IC50在1～30 nmol·L-1之间，体外抗HIV活性强[2]；2007年NFVR口服片剂获得SFDA国家一类新药证书及药品注册批文，并进入临床研究，I期试验表明，口服NFVR片剂在50～800 mg内安全性和可接受性良好，可考虑作为预防艾滋病性传播的阴道外用杀微生物剂。将NFVR制成水包油O/W型微乳，可将NFVR包裹于类脂核，形成粒径30～50 nm、热力学稳定的微乳体系[3]。考虑到阴道内给药效果还受到药物渗漏和药物滞留时间等的影响，将尼非韦罗微乳（nifeviroc microemulsion, NFVR/ME）与温度敏感型凝胶材料结合应用，可以增溶不同脂溶性的药物来提高它们的生物利用度[4]。其中，泊洛沙姆407（Poloxamer407，P407）是较为常用的一类新型阴道缓释药物载体[5]。

P407是具有高度亲水性三维网络结构的凝胶基质，可在阴道、子宫颈形成黏液层，起到化学物理屏障作用，同时，良好的黏膜表面生物黏附性和组织相容性及独特的溶液-凝胶转化性质使其具有制备简单、使用方便、与用药部位（阴道黏膜）亲和力强、滞留时间长等特点[6-7]。这是交联结构水溶性凝胶无法比拟的优点[8-9]。此外，由于P407可以把亲水性药物分布在胶束外的自由溶液中，而把脂溶性药物包裹在胶束内部。因此，药物对P407的影响以及药物的释放行为和相转变性的研究就显得非常必要[10]。而且，P407中药物释放量随着凝胶被阴道液稀释逐渐溶出，进入阴道组织间液体，可以在给药局部维持较高的浓度，适用于阴道用药，近年来亦有报道[11]。

作者在前期研究中[12-13]，通过ME技术制备NFVR/ME-TISG，研究凝胶中NFVR/ME的稳定性以及凝胶的流变性。本文作者尝试以NFVR为模型药物制备固体脂质体纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）O/W型微乳，将NFVR/ME与P407制成热敏原位凝胶（thermosensitive in situ gel，TISG），考察其相转变过程和微乳中NFVR的释药行为，为将NFVR/ME-TISG研发成为阴道杀微生物剂提供科学依据。

1 仪器与材料

Kinexus Pro 高级旋转流变仪（英国Malvern公司），动态激光散射粒度仪（英国Malvern仪器公司），透射电子显微镜（美国FEI公司），Ultra-cell超声仪（美国Sonicsand Materials公司），THZ-Q台式冷冻恒温振荡器（华美生化仪器厂），UV-2012 PC型紫外分光光度计（龙尼柯上海仪器有限公司），AX-20S电子天平（梅特勒-托利多仪器上海公司），XW-80A型漩涡混合器（上海精科实业有限公司），SB3200水浴式超声仪（上海必能超声有限公司）。

泊洛沙姆407（Poloxamer407，P407，德国BASF公司），尼非韦罗（nifeviroc，上海靶点药物有限公司，批号20110517，纯度质量分数为99.5%），羟丙甲基纤维素（hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC K4M，美国DOW化学公司），蓖麻油 （castor oil，日本Kawaken 公司），聚氧乙烯35蓖麻油（cremophor EL，德国BASF公司），聚乙二醇400（PEG400，日本SANYO公司），实验所用试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 NFVR/ME-TISG的制备

按文献[14]选用温控相图方法实现高温（75℃)制备NFVR/ME。以质量比为1.0∶3.0∶1.5比例称取处方量药用级蓖麻油、聚氧乙烯35蓖麻油和聚乙二醇400混合均匀，加入一定量NFVR置于75℃水浴加热，1 000 r·min-1磁力搅拌使其溶解作为油相，边搅拌边缓慢滴加75℃ 0.1 mol·L-1醋酸缓冲液（pH=4.0），冷却至室温即得NFVR/ME（A液）。称取处方量的P407、HPMC和甘油加入A液中，继续搅拌使其分散均匀，然后置于4～7℃冷室，直至聚合物充分溶胀（约48～72 h），即得透明均匀略带淡蓝色乳光的NFVR/ME-TISG，室温放置备用。

2.2 制备模拟阴道液（simulated vaginal fluid，SVF）

在1 L纯水中分别加入以下物质[15]（g）：NaCl（3.51）、KOH（1.40）、Ca(OH)2（0.22）、牛血清白蛋白（0.018）、乳酸（2.00）、醋酸（1.00）、甘油（0.16）、尿素（0.40）以及葡萄糖（5.00），溶解，用HCl调节pH至4.2。

2.3 粒径、ζ电位及形态测定

取适量NFVR/ME TISG用去离子水稀释适宜倍数，混匀，用动态激光散射粒度仪测定微乳粒径与ζ电位；同样，把稀释样品滴加在铜网上，室温条件下，质量分数为2%的磷酸钠溶液染色，用透射电镜观察所得NFVR/ME的微观形态。

2.4 相转变性研究

2.4.1 动态应变扫描检测凝胶温度和相转变温度

取NFVR/ME TISG 溶液1 mL，加入高级旋转流变仪测试盘，应变1.0%，温度精确控制在 ± 0.1℃内，升温范围为10～45℃，震荡频率为1.0 Hz，升温速度为1℃·min-1。以复数模量（G※）和复数黏度（η※）为指标，当η※= G※时，所对应的温度为为相转变温度（sol-gel transition temperature，Ts-g），另外，当η※和G※达到最高值时，所对应的温度为胶凝温度（gelation temperature，GT）。

2.4.2 稳态剪切速率扫描

采用Kinexus Pro 高级旋转流变仪，吸1.0 mL NFVR/ME-TISG加入流变仪试盘。温度控制系统：Peltier 平板温度控制单元；测量夹具：CP2/50椎板，直径50 mm，椎角2°。样品的温度精确控制在±1℃内，频率1 Hz应变0.05%。分别在20、25、30和35℃条件下，剪切速率范围0.1～1000 S-1，测定凝胶的复数粘度与剪切速率曲线[16]。

2.5 凝胶溶蚀动力学检测

无膜溶出模型研究凝胶的溶蚀动力学[17]。精密称取4℃的NFVR/ME-TISG（批号20111105）约5 g小心地加入到预先称重的玻璃平底容器中。在（37.0 ± 0.5)℃的恒温水浴振动器中预热10 min，使热敏凝胶溶液完全形成凝胶。然后加入37℃的体积分数为0.1%的甲醇模拟阴道液（SVF，pH4.2）2.4 mL作为释放介质，用频率100 r·min-1，振幅2.5 cm，恒温振荡30 min，立刻倾出全部释放介质，擦干容器，迅速称重并记录其质量，然后重复操作，直至剩余凝胶不足最初量的10%为止。相邻时间点样品的质量差异为在此期间的凝胶溶蚀量，并计算出累积溶蚀率：

式中：mo为加入介质前凝胶与容器的总重量（g），mi为第i次称重时凝胶与容器的总质量（g），mn为第n次称重时凝胶与容器的总质量（g）与Q对时间作图。

以Q为纵坐标，时间（t）为横坐标作图，得到凝胶经时溶蚀曲线。每次实验重复3次，结果取平均值。

2.6 凝胶中NFVR/ME释放度考察

在考察凝胶溶蚀动力学的同时测定NFVR/ME中NFVR的释放[18]。取溶蚀行为考察得到的释放介质样品2.0 mL，用体积分数为0.1%的甲醇SVF稀释至10 mL，超声振荡破坏其中的微乳以释放药物。经0.25 μm一次性无菌针头滤器过滤后，按照“2.7”条操作，记录测得的吸光度（A），由标准曲线方程求得释放介质中NFVR的含量，计算各时间点的累积药物释放量。

2.7 NFVR含量测定

2.7.1 检测波长的选择

按“2.1”条方法制备含1.0 g·L-1的NFVR/ME-TISG和空白微乳TISG作对照参比。在20℃精密吸取1.0 mL TISG溶液于10 mL量瓶中，加体积分数为0.1%的甲醇SVF定容至刻度，水浴超声振荡破坏其中微乳以释放NFVR，过滤，取续滤液为待测液。在200～400 nm进行紫外扫描。可见在270.55 nm处有最大吸收波长，且空白对照在此无干扰，已知原料药NFVR最大吸收峰是272 nm[19]，因此，在实际检测中，以272 nm为体外释药的检测波长。

2.7.2 标准曲线的建立

取干燥至恒重的NFVR原料药对照品10 mg精密称量，置于50 mL量瓶中，加体积分数为0.1%的甲醇SVF定容，制成200 mg·L-1标准贮存液。用标准贮存液分别配置浓度为1、2、4、8、20、40、50、60、70 mg·L-1的NFVR溶液，按照紫外-可见分光光度法（《中华人民共和国药典》2010年版二部附录IVA）以释放介质为空白参比，在272 nm测吸光度（A），以吸光度（A）为纵坐标，以质量浓度（ρ）为横坐标。采用最小二乘法，以A对质量浓度ρ拟合校准标准曲线，进行线性回归，采用Stata软件分析得工作曲线方程：

该方程表明NFNR质量浓度在1～70 mg·L-1内有良好的线性关系。最小检测量为1.0 mg·L-1。

2.7.3 分析方法的确证

依据“2.7.1”条，配制NFVR线性范围内低、中、高（20、40、60 mg·L-1）的样品，每一质量浓度制备并在日内测定5份样品；3 d连续制备并每日测定5个分析批，计算回收率及日内、日间相对标准偏差。结果日内RSD＜1.7%，日间RSD＜2.5%，本法的精密度符合要求。同时，测得高、中、低3个浓度样品的回收率平均为100.07%，平均RSD＜2%，该方法可靠且重现性较好。另外测定拟定临床用样品（1.0 g·L-1的NFVR/ME-TISG）NFVR含量为（0.98±0.06）g·L-1(n=3)。因此，本法可用于TISG样品中NFVR含量测定。

3结果与讨论

3.1 不同含药量的NFVR/ME 对粒径、ζ电位及形态的影响

由表1可知，当含药量在0.5～1.5 g·L-1时，凝胶中微乳的平均粒径（particle size,d）和ζ电位无明显变化。用透射电镜观察所得微乳的微观形态呈完整均一的球体，分散性良好（图1）。TISG中微乳粒径大小(d)和ζ电位及形态时评价微乳分散体系物理稳定性的重要指标，是表示带电微粒间相互作用力大小的重要参数，表1和图1说明，TISG中的NFWR/ME稳定性较好，微乳未被破坏。

表1 不同浓度的NFVR对微乳平均粒径、ζ电位的影响Table1 Average particle size (Z-Ave) and ζ potential of micro emulsion with different concentration of NFVR

图1 NFVR/ME-TISG的透射电镜图Fig.1 Transmission electron microscopy image of NFVR/ME-TISG

3.2 NFVR/ME-TISG相转变温度和胶凝温度的确定

胶凝温度（gelation temperature，GT）是凝胶体系中胶束聚集，已形成半固体状凝胶时的温度，而非形成凝胶的起始温度。采用Kinexus Pro高级旋转流变仪进行动态应变扫描不仅可测得GT，而且还能获得相转变温度。由于原位凝胶是高分子溶液具有粘性溶液和弹性固体的特征，本文作者采用复数黏度（η※）和复数模量（G※）2个参数随NFVR/ME-TISG温度从10℃升温至45℃的变化趋势，表征TISG的稳态黏弹性。由图2可见，TISG的η※和G※随温度上升均呈S形曲线，室温或较低温度下成液态，η※和G※值很低，分别为0.2和1.0 Pa·s；当温度升高至27～28℃后，η※和G※值呈指数增加，当TISG的η※= G※时，弹性愈加明显，为溶液形成凝胶的起始温度，即Ts-g为29.5℃。若温度继续升高，约5、6个温度单位，TISG显示出固态特征，进入平台期，为溶液形成半固体凝胶的温度，即GT为34.5℃。此时η※和G※可达到最高值，分别为845 Pa·s和100 Pa·s。当温度上升超过37℃，曲线急速下滑。

图2 NFVR/ME-TISG的相转变过程Fig. 2 Phase transition of NFVR/ME-TISG

复数模量是剪切模量的一种数学表示，为弹性模量（elastic modulus，G′）与黏性模量（viscousmodulus，G′）之和，是同一种黏弹性质不同角度的描述，它们不是相互独立的，而都是角频率ω的函数，并具有一定的换算关系。当η※和G※达到GT（34.5℃）时，胶束堆积越紧密，能形成的凝胶强度较大，在阴道内的成型性更好。

3.3 温度及剪切速率对复数粘度（η※）的影响

温度对NFVR/ME-TISG溶液的复数粘度η※曲线的影响见图3，在环境温度低于制剂相转变温度（Ts-g，30℃）时，如20、25℃时，η※值较小，前者维持在0.1 Pa·s，后者的η※值略有升高，亦只维持在0.5 Pa·s左右。此时η※不随剪切率变化而改变，呈现典型的牛顿流体特征。在30℃时，由于达到Ts-g，η※可陡然增大到100 Pa·s，在35℃时，η※最高可达到500 Pa·s，此时η※随剪切速率的升高而迅速减小，呈现出假塑性流体中特有的剪切变稀现象[20]。

各种生理温度条件下的黏度直接关系到本品制剂使用过程中患者顺应性和体内的治疗效果，因而粘度对本品制剂在由溶液向凝胶转变的过程中，其流变学性质以复数黏度（η※）的变化描述更为准确。

TISG中的泊洛沙姆在凝胶溶液中生成的疏水性PPO嵌段位内核，包裹着亲水性PEO外壳的球状胶束，随着TISG温度高于Ts-g（30℃）时，缔结在泊洛沙姆的疏水性PPO链段上的水分子将不断脱去，形成更多胶束；温度进一步升高（＜37℃），其中亲水性PEO链段也脱去水分子，互相缠结堆砌，形成半固体状的TISG。此时，胶束之间发生相互聚集增强，内摩擦力势必增大。由于剪切力可破坏TISG的结构，使胶束和单体数目增多，聚集减少，出现图3所示的假塑性流体特有的剪切变稀现象，与文献[21-22]一致。

本制剂所具有的这一流变性质，推测在实际性生活时，一定的或不断增加的剪切速率可使其粘度下降，减少对阴茎抽动时的阻力，更易被使用者接受。

图3 不同温度时剪切速率对TISG复数黏度η※/(Pa·s)的影响Fig.3 Influence of the shear rate on the complex viscosity (η※/(Pa·s))of TISG at different temperature

3.4 凝胶溶蚀与药物NFVR释放随时间的动力学特征

图4表示当振荡频率为100次·min-1时，凝胶溶蚀和微乳中药物释放曲线。由该图可见，无论凝胶溶蚀还是微乳中NFVR药物的释放行为均以恒定的速率进行，遵循零级动力学方程（Zero-onderkinetics），显示出零级释放行为特征，凝胶中NFVR释放稍慢于凝胶溶蚀，NFVR在凝胶中释放94.31%的时间约为330 min，表明凝胶溶蚀是控制NFVR释放的主要因素，原因可分为两点：a.泊洛沙姆热敏制剂为水溶性凝胶，其表面遇到水性介质易被溶蚀而降解；b.NFVR是难溶性药物，较难在水性介质（1%甲醇SVF）中发生扩散行为[22]。

图4 凝胶溶蚀与药物释放随时间的动力学特征Fig. 4 Cumulative gel dissolved versus time and cumulative drug released from gel versus time

3.5 药物释放与凝胶溶蚀的关系

药物释放与凝胶溶蚀的关系见图5。由图5可知，药物的累积释放率（cumulative drug released from gel versus time）可在凝胶的累积溶蚀率（cumulative gel dissolved from drug released versus time）增加而增加，两者之间存在良好的线性关系（R2=0.98），说明微乳中NFVR在P407热敏凝胶中释放受凝胶溶蚀控制，这种释药方式可以避免产生突释放效应，增强了其给药的依从性与其他研究者的实验结果相一致[23]，同时由于热敏凝胶在阴道中的滞留时间较普通凝胶长，增强药物的生物利用度和药效。

图5 药物累积释放量与凝胶的累积溶蚀量之间的关系Fig. 5 Correlation between cumulative gel dissolved and cumulative nifeviroc released

4结论

NFVR/ME为本品的主药，与P407制成NFVR/ME-TISG。HPMC与P407合用凝胶提高了NFVR/ME的滞留性，而且室温下具有一定的流动性和温度敏感性。实验表明，含NFVR/ME从热敏原位凝胶中的释放，受凝胶溶蚀情况的控制，随时间呈现零级动力学特征。其主要原因：首先本品制剂为水溶性凝胶，其表面遇到水性溶质易被溶蚀而降解；其次，NFVR水溶性差，难在水性介质中发生扩散行为。这种由溶蚀控制药物释药方式可以避免突释效应。本品在相似阴道生理温度（35～37℃）形成的凝胶的剪切复数粘度呈现频率依赖性，能有效提高临床使用者的顺应性和可接受性。

作者认为，本制剂中P407的浓度对GT和Ts-g的作用是影响凝胶粘弹性、溶蚀速率以及NFVR释放速率等性质的主要原因。热敏原位凝胶是一种具有应用前景的新型阴道用释药系统 。

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In vitrodrug release and phase transition of nifeviroc microemulsion thermosensitive in situgel

WANG Yu-zhu1, ZHI Rui-na1,2, LAN Meng-ning3, YANG Kai1, LI Wei-hua1,2*, DING Xun-cheng1
（1.State Key Labs of Family Planning Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China; 2. Fudan University Medical College, Shanghai 200032, China; 3. Malvern Instruments (China) Ltd., Shanghai 200233, China)

ObjectiveTo prepare a kind of microemulsion thermosensitive in situ gel (ME-TISG) with nifeviroc（NFVR）as a model drug , and to explore its pharmaceutical properties. Methods Nifeviroc microemulsion(NFVR/ME) were prepared by temperature (75℃) control phase diagram and loaded into P407 gel. The particle size, ζ potential and morphology of the ME were analyzed by ZetePALS Zeta Potential Analyzer and Transmission Electron Microscope, and the rheology property was determined by Senior rotary rheometer. The correlation between NFVR/ME release and gel dissolution under a frequency of 100 r·min-1was studied using non-membrane model. Results Average particle size of different concentration NFVR/ME was 36.30-38.25 nm and ζ potential was -7.15--7.22 mV. It showed that the micromorphology of ME was in round flat sphere shape. Sol-gel transition temperature and gelation temperature of the TISG was 29.5℃ and 34.5℃ respectively. NFVR/ME-TISG appeared to be newtonian fluid at low temperature (＜25℃) with low viscosity. The viscosity of ME increased as temperature rose and it showed a typical pseudoplastic fluid characteristics as to 35-37℃. The complex viscosity decreased gradually with the increase of shear rate, suggesting a shear-thinning behavior. In vitro release rate of NFVR was controlled by gel dissolution rate with good linear relationship (R2=0.98), following the zero order kinetics. Such gel dissolution-controlling drug release mode can avoid burst release effect. Conclusion ME-TISG is a promising new vaginal drug delivery system.

pharmaceutics; nifeviroc; microemulsion; thermosensitive in situ gel; complex viscosity; sol-gel transition temperature; gelation temperature; in vitro drug release

R 94

A

（2014）04–0131–10

(本篇责任编辑：吕向一)

2014–02–25

国家十二五科技支撑计划资助项目（2012BAI31B04）；十二五国家科技重大专项（2012ZX10001007-009-003）；上海市人口和计划生育委员会（2012JG03）；十二五国家科技重大专项（子任务）（2013ZX10001006-003-002）；国家自然科学基金青年基金资助项目（81100459）

王玉柱（1985-），女（汉族），上海人，研究实习员，主要从事新药制剂的研究，Tel. 021-64437475，E-mail wangyuzhu19850408@163.com；＊通讯作者：李卫华（1973-），女（汉族），辽宁沈阳人，博士，研究员，主要从事计划生育新药的研发，Tel. 021-64437475，E-mail iamliweihua@yahoo.com。