罗格列酮对大鼠急性肾损伤的保护作用及机制探讨

谷名晓，江 璐，刘选成

(青岛市妇女儿童医院，山东青岛266034)

急性肾损伤是多种原因造成的短期内肾功能的急剧下降，是影响机体多器官、多系统的临床危重症之一，发病率逐年增高。氧化应激反应是急性肾损伤发生、发展的重要机制。活性氧(ROS)与蛋白质、脂肪、核酸、碳水化合物以及其他分子发生强烈反应并使之变性引起炎症反应、凋亡、纤维化和细胞增殖［1，2］。过氧化物酶体增殖物激活受体 γ(PPAR-γ)罗格列酮(RSG)是噻唑烷二酮类药物，因其具有改善胰岛素抵抗、降糖等作用作为胰岛素增敏剂广泛应用于临床。近年研究［3］表明，除了上述作用外，RSG还具有抗炎抗氧化及直接的肾脏保护作用，但其具体机制尚未完全明了。本研究观察了RSG对大鼠急性肾损伤的保护作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级SD大鼠30只，2月龄，体质量300～350 g，徐州医学院实验动物中心提供;庆大霉素(GEN)，RSG，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒，图像采集及分析(LEICA QWIN)，752紫光光栅分光光度计，LEICA Qwin图像处理与分析系统，NikonE600显微摄像系统，PSD-156生化分析仪，TGL-16B台式离心机，紫外分析仪。

1.2 动物分组及GEN用法 将30只大鼠随机分为诱导组、干预组、对照组各10只，诱导组、干预组持续腹腔注射GEN 2周，剂量100 mg/(kg·d)，复制急性肾损害模型［4］，干预组同时以RSG 10 mg/(kg·d)灌胃，诱导组以生理盐水灌胃，共2周;对照组不复制急性肾损害模型，单纯以生理盐水灌胃，共2周。

1.3 观察方法 将大鼠置于代谢笼中，分别于注射药物前1 d及实验第15天称取每只大鼠的体质量，计算体质量变化(注射药物前1 d与实验第15天的差值)。实验第15天收集24 h尿液，并记录。后采用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，摘眼球取静脉血3 mL，采用全自动生化分析仪检测尿素氮、肌酐。取大鼠左肾(右肾用于制备肾组织匀浆)，置于10%中性甲醛中，经脱水、包埋制成蜡块，切片后行HE染色，显微镜下观察肾组织病理学变化。采用Allen［5］的方法半定量评价肾组织的损害程度，对每张切片观察50个近端小管，观察有无肾小管坏死、上皮细胞空泡变性及间质炎性细胞浸润三种病理学特征，对肾小管坏死、上皮细胞空泡变性及间质炎性细胞浸润程度进行评价。肾小管坏死程度:0级表示正常肾小管，1级表示肾小管轻微伤害(＜25%肾小管受累)，2级表示肾小管中等伤害(25% ～50%肾小管受累)，3级表示肾小管严重伤害(50%及以上肾小管受累)。上皮细胞空泡变性程度:0级，光镜下可见正常肾小管上皮细胞空泡;1级，可见上皮细胞肿胀，胞质淡染并且遍布微小空泡;2级，可见空泡变性主要发生在近端小管段，肾小管上皮细胞肿胀，胞质内出现边界清晰的巨大空泡，空泡含液体;3级，可见肾小管上皮细胞融合，含铁血黄素沉积、包涵体。间质炎性浸润程度:0级表示无浸润，1级表示少量分散的炎性细胞，2级表示成组的炎性细胞，3级表示广泛的炎性细胞浸润。取保存的右肾皮质，加冰冷生理盐水，剪碎研磨制成组织匀浆，低温离心取上清液后，严格按照南京建成公司试剂盒说明书操作，采用化学比色法测定MDA、SOD、GSH活性。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料以±s表示，各组间均数差异采用t检验。各组肾组织病理学评价的统计分析采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比较 结果见表1。

表1 各组大鼠体质量变化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比较(± s)

表1 各组大鼠体质量变化、24 h尿量、尿素氮、肌酐比较(± s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与诱导组比较，ΔP ＜0.05

组别 体质量变化(g)24 h尿量(mL)尿素氮(mg/dL)肌酐(mg/dL)诱导组 －8.35±3.45*24.82±3.05* 126.3±8.9* 1.81±0.1*干预组 11.68±3.43*Δ14.08±0.79*Δ 53.9±7.0*Δ 0.64±0.15*Δ对照组36.00±2.90 8.27±0.71 36.0±4.8 0.39±0.1

2.2 各组大鼠肾组织病理学变化 显微镜下显示，对照组大鼠肾脏的组织形态结构变化不明显;诱导组表现为近端肾小管上皮细胞刷状缘脱落、坏死、胞质空泡变性，肾小管坏死，管腔内可见蛋白管型及红细胞管型;干预组大鼠病变较诱导组轻。见图1～3。

图1 对照组大鼠肾组织病理学变化(HE，×400)

图2 诱导组大鼠肾组织病理学变化(HE，×400)

图3 干预组大鼠肾组织病理学变化(HE，×400)

2.3 各组大鼠肾组织损伤程度的分析比较 结果见表2。与对照组比较，诱导组和干预组肾小管坏死、上皮细胞空泡变性、间质炎性细胞浸润程度轻(P均＜0.05);与干预组比较，诱导组肾小管坏死、上皮细胞空泡变性、间质炎性细胞浸润程度重(P均＜0.05)。

表2 各组大鼠肾小管坏死、空泡细胞空泡变性及间质细胞浸润程度比较(只)

2.4 各组大鼠肾组织GSH、MDA、SOD活性比较结果见表3。

3 讨论

GEN是一种临床上广泛使用的氨基糖苷类抗生素，因其具有耳肾毒性，在临床应用受到限制，目前对其引起肾损伤确切机制仍不明确［6］。近年研究［7，8］表明，ROS 释放、脂质过氧化及炎症介质释放是GEN引起肾毒性的主要因素。氨基糖甙类抗生素诱导的肾小管细胞损伤发病机制为溶酶体、线粒体等细胞膜结构改变。氧自由基能攻击生物膜磷脂中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，同时脂质过氧化产生的自由基和醛类丙二醛均具有直接细胞毒性作用，造成生物膜损伤，影响细胞的功能［9］。GSH氧化还原循环系统是细胞内最重要的抗氧化系统之一，而GSH和SOD是该循环系统中最重要的两种化合物，SOD是体内最重要的抗氧化酶，对于维持细胞的完整性，参与细胞代谢有重要意义，肾组织中GSH和SOD的消耗可直接反映肾组织氧化损伤程度［10，11］。MDA是由自由基产生的脂质过氧化代谢产物，引起脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物主要成分，MDA含量可以反映体内脂质过氧化程度，已普遍用作检测机体组织中氧化应激水平的指标，所以同时检测MDA含量和SOD，GSH活性可了解自由基产生和抗氧化系统的功能状态［12］。

表3 各组大鼠肾组织GSH、MDA、SOD活性比较(± s)

表3 各组大鼠肾组织GSH、MDA、SOD活性比较(± s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与诱导组比较，ΔP ＜0.05

组别 GSH(μmol/g) MDA(nmol/g) SOD(U/mg)诱导组 59.6± 4.5 97.4±14.6* 107.2±9.2*干预组 69.2± 6.8*Δ 48.8± 4.5*Δ 133.9±5.1*Δ对照组 112.5±12.5*38.9± 5.7 158.1±4.2

最近研究［13，14］表明，PPAR-γ 激动剂，在体外和在体内表现出抗炎作用。PPAR-γ激动剂减少炎症细胞因子的分泌如TNF-α和IL-1b，抑制巨噬细胞的激活。本研究显示，诱导组、干预组大鼠24 h尿量高于对照组，表明存在GEN诱导大鼠产生多尿;而干预组大鼠24 h尿量低于诱导组，提示RSG对急性肾小管坏死的保护性作用。本研究还发现，诱导组、干预组尿素氮、肌酐较对照组升高，提示GEN可使肾功能发生损害;而干预组尿素氮、肌酐较诱导组降低，提示RSG能通过保留肾细胞的结构完整性，降低血清尿素氮和肌酐水平。本研究诱导组大鼠ROS、MDA水平较对照组升高，SOD水平较对照组降低，且同时发现诱导组大鼠肾小管上皮细胞局灶性颗粒空泡变性，上皮坏死及脱落，小管腔中出现颗粒状碎屑，表明诱导组肾组织氧化还原系统受损，且受损部位主要位于肾小管，推测GEN引起的肾功能损害与氧自由基代谢失衡，ROS代谢产物增加引起氧化应激有关，目前一些抗氧化剂已被用来防止GEN 肾毒性［15］。

总之，RSG对氧化应激所致的急性肾损伤有保护作用，其机制可能与上调GSH、SOD水平及下调MDA水平有关。

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