贲门腺癌组织中 RKIP、NF-κBp65 的表达变化及意义

魏 红，齐淑静，刘文利，徐 亮，李丽东，李 华，董稚明，张向阳

(1河北工程大学附属医院，河北邯郸056000;2邯郸市第四医院;3河北医科大学肿瘤研究所病理研究室)

贲门腺癌(GCA)被认为是胃癌的特殊类型，国际上对GCA的定义尚无统一标准，目前均以癌中心的解剖学位置作为分类标准。GCA主要的治疗方法是手术治疗，但患者较多因肿瘤复发和转移发生死亡，预后差。因此，进一步了解GCA癌变的分子学机制，探索早期、高度敏感性和特异性的生物学诊断指标，寻求有效的防治手段，为临床防治研究及预后评价提供理论依据，具有重大的理论意义和应用价值［1，2］。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族中的一员，其在大肠杆菌、植物酵母、线虫、果蝇、开花植物和哺乳动物的不同组织中均有表达［3～5］。研究［6］显示，RKIP 具有抑制肿瘤细胞转移的作用，这已在各种肿瘤中得到证实，它可能位于肿瘤抑癌基因和原癌基因上游而发挥重要作用。核因子-κB(NF-κB)是来源于Re1家族的转录因子，广泛存在于哺乳动物处于静止期的细胞中，以非活化形式存在于细胞质中，它具有调节细胞增殖和凋亡、调节免疫和炎性反应的作用。2008年1月～2013年10月，我们观察了GCA组织中RKIP、NF-κBp65的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年1月～2013年10月河北工程大学附属医院收治的GCA患者160例，男118例，女42例;年龄37～83(61.8±8.7)岁，其中＜60岁者58例，≥60岁者102例;所有患者均经病理证实，且术前均未行放化疗。按2002年修改的国际抗癌联盟(UICC)和美国肿瘤联合会(AJCC)制定的TNM分期第6版标准进行分期，Ⅰ﹢Ⅱ期70例，Ⅲ+Ⅳ期90例;肿瘤分化程度高分化41例，中分化54例，低分化65例;有淋巴结转移92例，无淋巴结转移68例。患者接受术后时留取癌组织160例份(腺癌组)，同时留取距癌组织5cm处的非癌组织160例份(癌旁组)。

1.2 RKIP、NF-κBp65的检测方法 标本获取后立即放于液氮保存并固定于10%中性甲醛之中，以便制作蜡块用作免疫组织化学蛋白表达的测定。采用HE染色确定肿瘤标本主要是由肿瘤组织构成，并确定癌旁组织没有肿瘤细胞浸润。采用免疫组化SP法试剂盒(北京中杉金桥公司产品)检测RKIP蛋白在GCA和癌旁正常贲门组织中的表达，以PBS代替RKIP多克隆抗体作为空白对照，已知阳性片做阳性对照。应用鼠抗人NF-κB单克隆即用型抗体及PV-6000免疫组化试剂(北京中杉生物技术有限公司)检测NF-κBp65蛋白在GCA和正常贲门组织中的表达，按照PV-6000二步法免疫组织化学染色试剂盒说明操作，DAB显色，以PBS代替一抗作为阳性对照，用已知阳性切片作阳性对照。结果判断标准:RKIP阳性染色定位于细胞质，部分可出现细胞膜着色;NF-κBp65免疫组化阳性着色主要位于胞核或胞质。RKIP和NF-κBp65蛋白表达采用双评分半定量法进行评分，RKIP在细胞质及 NF-κBp65在细胞核和(或)细胞质有浅黄色、棕色、棕褐色颗粒沉着为阳性细胞，高倍镜下根据染色强度和阳性细胞所占比例进行结果判定。染色强度评分标准:不着色，0分;黄色，1分;棕黄色，2分;棕褐色，3分。阳性细胞所占比例的评定标准:阳性细胞率≤25%为0分，26% ～50%为1分，51% ～75%为2分，＞75%为3分。两项评分相加，0～1分为阳性(－)，2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 采用 SPSS11.5 及 PPMS1.5［7］统计软件。采用Wilcoxon方法分析两组RKIP和NF-κBp65的表达差异，RKIP、NF-κBp65在GCA中的表达及其与临床病理特征的关系采用χ2检验，GCA组织中RKIP与NF-κBp65蛋白表达的相关性用Spearman等级相关分析。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 两组RKIP、NF-κBp65表达比较 腺癌组及癌旁组RKIP阳性表达率分别为38.75%、75.00%，两组比较，P ＜0.01;NF-κBp65阳性表达率分别为75.625%、20.000%，两组比较，P ＜0.01。

2.2 RKIP、NF-κBp65 表达与 GCA 临床病理特征的关系 结果见表1。由表1可知，RKIP阳性表达与GCA淋巴结转移有关(P＜0.05);NF-κBp65阳性表达与GCA临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关(P 均 ＜0.05)。

表1 RKIP、NF-κBp65表达与GCA临床病理特征的关系

2.3 GCA组织中RKIP与NF-κBp65阳性表达的关系 GCA组织中RKIP与NF-κBp65表达呈负相关(r= －0.431，P ＜0.01)。

3 讨论

GCA是我国北方特别是河北省的磁县、涉县及河南省的林县等地常见的恶性肿瘤之一，其发病特点是具有明显的地域性和家族聚集性。现学者普遍认为，GCA指发生于贲门黏膜上皮及贲门腺体的癌，主要指原发于或中心位于食管胃黏膜交界线向下2cm范围内的癌［8］。因此，现在GCA已作为一种独立的疾病来研究［1］。在过去的30年间，GCA发病率每年以每年20%的增长率逐渐升高［9］，增加了近6倍［10］，增长速度是所有恶性肿瘤中最快的一种［11，12］。而且，GCA 早期不易发现，临床就诊病例多为中晚期，治疗效果较差，缺乏应用于早期诊断的敏感性、特异性指标和手段以及高效特异的防治措施和方法，是造成GCA病死率较高的重要因素，所以对GCA的发病机制、早期诊断、早期预防的研究日益受到重视［13］。

已有研究［14～16］显示，RKIP 参与细胞内多条信号转导通路的调节，具有抑制 Raf-1-MAPK、NF-κB信号通路和激活G蛋白信号转导通路活性的作用，而这些信号转导通路的异常活化与肿瘤发生、发展密切相关，提示RKIP表达异常参与了肿瘤发生、发展和转移。Keller等［17］发现，RKIP是前列腺癌的转移抑制基因，在转移的前列腺癌细胞中，RKIP mRNA和蛋白表达水平均低于非转移的前列腺癌细胞，特别是在良性组织中RKIP表达水平最高，而在转移的肿瘤组织中表达减少甚至检测不到。上述报道表明，RKIP功能的丧失与前列腺癌转移呈正相关。FU等［6］报道，上调前列腺癌细胞中的RKIP表达能使癌细胞的体外侵袭能力降低、降低前列腺癌裸鼠移植瘤的转移能力。因此，RKIP现已被用作前列腺癌的一个新的诊断标志物［18］。Schuierer等［19］认为，转移的黑色素瘤中RKIP表达水平显著下降，超表达RKIP可以抑制高转移性黑色素瘤细胞的转移能力。而在乳癌中也有相似报道［20］。上述报道提示，RKIP参与了肿瘤转移的调控，RKIP功能的丧失能增强转化细胞的侵润能力，从而促进转移的发生。本研究显示，腺癌组RKIP阳性率低于癌旁组，RKIP阳性表达与GCA淋巴结转移有关，表明RKIP表达的减少或缺失与有无淋巴转移有关联，RKIP可能参与了GCA的发展、侵袭和转移。

NF-κB是来源于Re1家族的转录因子，广泛存在于哺乳动物处于静止期的细胞中，以非活化形式存在于细胞质中，它具有调节细胞增殖和凋亡、调节免疫和炎性反应的作用。以往研究［16］表明，RKIP参与了NF-κB信号通路的调控，抑制RKIP能增强NF-κB的转录，而过表达RKIP能减少NF-κBp65基础水平的转录。这种作用不依赖丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路，而是RKIP能与NF-κB激活途径的4种激酶NIK、TAK1、IKKα和IKKβ相互作用。RKIP还可以抑制肿瘤坏死因子α诱导的NF-κB抑制物激酶活性，从而抑制NF-κB激活。有研究者运用免疫组化法检测了 NF-κB 在结肠癌［21］、乳腺癌［22，23］及舌鳞状细胞癌［24］组织中的表达，其在癌组织中的表达明显高于正常组织，并与其组织学分级、TNM分期、淋巴结转移明显相关，且有增高趋势。同样，在对肝癌的研究中、NF-κBp65表达阳性患者1、3年生存率明显低于阴性患者，提示NF-κBp65与肿瘤发生和预后密切相关［25］。本研究显示，腺癌组NF-κB阳性表达率高于癌旁组，NF-κB阳性表达与GCA临床分期、肿瘤分化程度、淋巴结转移有关，GCA组织中RKIP与NF-κBp65表达呈负相关，本文结果与既往的研究结果一致。我们认为，GCA组织中RKIP表达下降时NF-κBp65表达增高可能是由于IκB激酶即 IKK，被激活后可鳞酸化 IκB，进而IκB降解释放出NF-κB转移入核启动靶基因(如CyclinD1、c-myc和抗凋亡基因等)转录表达。当NF-κB被过度激活，定位于细胞核而不能返回细胞质时，与细胞核内特定基因启动子区域位点结合，启动靶基因转录而致表达增强。

总之，RKIP表达下调或缺失与GCA的侵袭和转移有关，RKIP表达减少或缺失可能通过上调NF-κBp65的表达促进GCA的侵袭和转移，但其具体的作用机制还有待进一步研究。

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