细胞趋化因子SDF－1α对小胶质细胞趋化作用的研究

徐 逸 汪 琦 王 伟 朱 舟

小胶质细胞是中枢神经系统（central nervous system，CNS）内固有的免疫细胞，是CNS内的巨噬细胞，对中枢的内环境起监视作用，是中枢的第一道防护屏障，其树枝一样的突起具有高度的活化能力［1］，能够吞噬细胞碎片和有害物质，将抗原呈递给淋巴细胞，维持CNS内环境的稳定。大量研究表明小胶质细胞在CNS疾病的发病机制中起着“双刃剑”的作用：一方面，活化的小胶质细胞能够分泌大量细胞毒性物质如一氧化氮、炎性因子、活性氧自由基等，参与神经元的变性，加速疾病的进展；另一方面，很多研究也发现病灶周围小胶质细胞的聚集和活化是机体对不利因素的自我防御反应，活化的小胶质细胞能够发挥吞噬和清除作用，在疾病的进展中起到有利的保护作用。小胶质细胞如何趋化至病灶附近目前机制尚不明确，但研究显示趋化因子可能参与了小胶质细胞的趋化过程。

趋化因子是一类可趋化、吸引并激活炎症细胞的小分子多肽，基本功能是对表达有相应特异性趋化因子受体的细胞发挥定向趋化作用［2］。趋化因子也表达于CNS中，当脑组织发生炎症、缺血和缺氧等病变后在炎性细胞因子、缺氧诱导因子－1（HIF－1）以及血管内皮细胞生长因子（VEGF）等细胞因子的作用下损伤局部的小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元和血管内皮细胞等可表达或分泌趋化因子，多种趋化因子表达上调，趋化因子与其受体相互作用，可趋化炎症细胞聚集、上调粘附分子表达、促进神经修复、参与神经再生，进而加重神经组织损伤或发挥保护作用。

在众多趋化因子中基质细胞衍生因子－1（stromal cell derived factor－1，SDF－1）是非常重要的一员。SDF－1具有广泛的生物学活性，在免疫、造血、神经、心血管系统发育以及人类免疫缺陷病毒感染中发挥重要作用。在正常脑组织中神经元、神经胶质细胞和血管内皮细胞可持续低水平表达SDF－1和 CXCR4［3］。目前研究认为 SDF－1 及其受体在CNS的发育过程中参与调节多种神经细胞迁移［4，5］，促进海马齿状回、小脑和新皮质的组织结构形成［6，7］，并在 胶 质 细 胞 增 生［8，9］和 CNS 神 经 突 触信息传递［10，11］等多个生理过程中发挥重要作用。

本研究采用迁移实验观察SDF－1在离体对小胶质细胞的趋化作用，并通过脑室注射趋化因子SDF－1后观察小鼠脑内小胶质细胞的变化，为探索脑内小胶质细胞的趋化迁移机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

重组小鼠SDF－1α购于R＆D公司；兔抗GFAP多克隆抗体购于美国Neomarkers公司；兔抗Iba－1多克隆抗体购于 Wako公司；ECL超敏显色试剂盒、蛋白提取试剂盒购于美国Pierce公司；DMEM／F12培养基；胎牛血清、小牛血清购于Hyclone公司；olomoucine、Aprotinin、AMD3100、4，6－diamidino－2－phenylindole（DAPI）购于 Sigma公司；8μm Transwell小室购于Corning公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG购于北京中杉金桥生物公司；驴抗兔CY3购于美国Jackson ImmunoReseach公司；兔抗actin多克隆抗体购于武汉博士德生物公司；蛋白分子量Marker购于日本Fermentas公司。

1.2 BV2细胞的培养及迁移实验

小胶质细胞系BV2细胞由本实验室冻存。取出24孔Transwell板（图1），用无血清的DMEM／F12培养液在培养箱中平衡1 h；BV2细胞培养至80%融合时用0.25%胰酶进行消化，无血清培养基洗涤2次，计数，配制成2×105／ml的细胞悬液；上室每孔加人100μl细胞悬液；下室分别加入含不同浓度的重组小鼠 SDF－lα（0、50、100、200、500 ng／ml）的无血清DMEM／F12培养基500 ul；阻断实验：趋化实验前将BV2细胞用含CXCR4受体拮抗剂AMD3100 2.5μg／ml的无血清DMEM／F12培养基预处理30 min，取100 ul加入上室，下室加入200 ng／ml的SDF－1α500 ul；置于37℃5%CO2培养箱中孵育6 h；孵育完成后将膜的下表面置于PBS中并擦去上表面未迁移的细胞；用0.1%的结晶紫对膜进行染色20 min，用清水洗3次，然后在显微镜下观察细胞，计算迁移细胞数，每孔计算5个高倍镜视野（×200倍）的细胞均数；计算迁移指数：为消除不同实验中对照孔引起的迁移背景不同，结果采用迁移指数表示，迁移指数＝实验组迁移细胞数／对照组迁移细胞数（表1）。

表1 迁移实验分组表

图1 Transwell板

1.3 小鼠侧脑室注射

28周龄C57小鼠分别予以SDF－1α（10ug／ml，用PBS配制）和PBS 10ul侧脑室注射，每周1次，连续注射8周。侧脑室注射的具体方法如下：小鼠在Kopf立体定位仪上通过面罩予以1.5%安氟醚、70%N2O／30%O2气体麻醉；对小鼠头顶部进行备皮，用75%的酒精擦拭小鼠头部皮毛，用消毒后的手术剪剪开头顶部皮肤，暴露出颅骨前囟；双侧脑室套管（26 gauge；Plastics One，Roanoke，VA）通过牙科固定粉固定于颅骨，定位为前囟后0.5 mm，侧1.0 mm，深2.5 mm；注射时取出套管内插管，连接微量注射器，每次以1μl／min的速度注射6μl由PBS稀释的10μM重组小鼠源性SDF－1α或PBS。

1.4 免疫荧光染色

制备冰冻切片：将麻醉后小鼠断头取脑后用OTC胶包裹，放入－70℃戊二烷中速冻1 min；切片前取出待切组织放入－20℃冰箱复温；于－20℃恒冷箱切片机中连续切片，片厚10μm，固定于多聚L赖氨酸包被的载玻片上，在距前囟点－1.7～－3.08 mm距离于冠状位进行切片，每间隔150μm取五张为一组，共6组。冰冻切片置4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中（4℃）固定15 min；PBS振荡清洗3次，每次5 min；正常牛血清封闭2 h；将一抗（兔抗Iba－1抗体，1∶1000）用抗体稀释液按比例稀释后滴加在脑片上，以盖住脑组织为最低量，4℃冰箱湿盒内孵育过夜；弃去一抗，PBS振荡清洗3次，每次5 min；滴加二抗即羊抗兔Cy3（1∶200），室温避光孵育l h；PBS振荡清洗3次，每次5 min；50%甘油封片，于电子荧光显微镜下照相存档。

1.5 Western blot检测

将实验组小鼠大脑取出放入干净EP中，按照100 g组织加入400μl裂解液的比例加入相应体积的三去污细胞裂解缓冲液，匀浆后冰上放置10 min；12 000 r／min离心10 min；取上清转入一干净Ep管中；应用BCA法检测蛋白浓度。等量蛋白质（30 ug／lane）加入5×加样缓冲液，煮沸3 min后上样；在制备好的SDS聚丙烯酰胺凝胶（分离胶12%，积层胶5%）垂直电泳分离，然后全湿式电转法经电转移转至NC膜上（150 m A恒流4℃转膜60 min），室温下用含5%脱脂奶粉的TBS－T（10m M Tris·Cl／100 m M NaCl＋0.1%Tween20）封闭2 h，加入一抗4℃慢摇过夜，第2 d用TBS－T于室温下洗膜4次，每次15 min，接着加入辣根过氧化物酶偶联二抗，在室温下轻轻摇动2 h，然后同样用TBS－T室温下洗膜4次，最后按说明要求加入ECL试剂，室温下浸泡2～4 min后曝光（根据发光强度曝光1s～2 min不等），洗片机洗片。用SynGene成像系统拍照并进行条带分析，以测定目的基因的表达水平。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度SDF－1α对小胶质细胞趋化的影响及SDF－1α给药浓度的确立

在24孔Transwell板上进行的体外迁移实验中膜下表面的迁移细胞用0.05%的结晶紫染色后呈紫色。与对照组比较，在50、100、200、500 ng／ml四种不同浓度SDF－1α作用下BV2细胞的迁移指数均有所增加，在200 ng／ml时迁移指数最大，与对照组比较有显著差异（P＜0.05）。用SDF－1受体 CXCR4的拮抗剂AMD3100 2.5μg／ml预处理BV2细胞，能显著抑制SDF－1α对BV2细胞的迁移指数（P＜0.05）（表2、图2）。

表2 迁移实验的BV2迁移指数

图2 迁移实验的BV2迁移指数与对照组比较，＊P＜0.05；与趋化实验SDF－1α200 ng／ml组比较，＃P＜0.05

2.2 SDF－1α注射可增加皮层和海马小胶质细胞的数量

为了研究侧脑室注射该趋化因子后能否增加脑组织中小胶质细胞的数量，本研究对正常小鼠分别予以PBS和SDF－1α观察小胶质细胞的变化。小胶质细胞由多克隆兔抗Iba－1标记。小胶质细胞计数表示为一定面积内小胶质细胞的数量与该面积的比值所得到的一个平均系数。SDF－1α干预组小胶质细胞数量比PBS组明显增多，细胞密度增大（图3）。SDF－1干预组与PBS组比较，皮层和海马小胶质细胞计数分别为5.660×10－5±1.050×10－5VS 3.573×10－5±0.553×10－5，5.509×10－5±0.633×10－5VS 3.640×10－5±0.377×10－5，分别增加了1.58倍和1.513倍（P＜0.05，图4）。进一步进行小鼠全脑 Western Blot检测，发现SDF－1α干预组脑组织中Iba－1表达量也明显增加（图5）。

图3 A为WT小鼠侧脑室注射PBS后皮层小胶质细胞数量的情况；B为 WT小鼠侧脑室注射SDF－1后皮层小胶质细胞数量的情况（Bar＝50 um）

图4 WT小鼠干预后海马（A）和皮层（B）小胶质细胞计数 与 WT＋PBS组比较，＊P＜0.05

图5 A为SDF－1干预后Iba－1蛋白表达水平的变化；B为SDF－1干预后Iba－1蛋白表达水平 与 WT＋PBS组比较，＊P＜0.05

3 讨 论

小胶质细胞是存在于中枢的巨噬细胞，被认为是CNS的第一道免疫防线。正常情况下脑实质内的小胶质细胞呈分枝状并形成密集的网络，在维持脑部环境的稳定中起重要作用。

对于小胶质细胞的来源至今也存在很多争议。目前，大多数研究者认为小胶质细胞和位于肝、脾和肺部的巨噬细胞一样，都来源于骨髓造血系统［12］。而CD34＋的造血前体细胞可能是小胶质细胞前体细胞的主要来源［13，14］。在成年个体的CNS即使是在生理情况下单核／巨噬细胞这种由骨髓经外周循环到CNS的沟通也持续存在［15］，而在病理情况下这种沟通会大大增强［16～20］。Luc Vallie｀res等人的研究证实，进入成年个体CNS的骨髓来源的细胞并不能分化为神经元、大胶质细胞或者内皮细胞，而是主要分化为小胶质细胞［18］。而且越来越多的研究证实，骨髓细胞能够穿过血脑屏障并分化为有功能的小胶 质 细 胞［15，17，18，21，22］。此 外，研 究 发 现 新 分 化的血液来源的小胶质细胞表面表达高水平的CD11c，而该蛋白在脑内固有小胶质细胞呈现低水平表达。CD11c在抗原呈递中发挥重要作用，提示这类骨髓来源的小胶质细胞可能比脑内固有的小胶质细胞具有更强大抗原呈递和吞噬功能［15］。

骨髓干细胞／前体细胞的定向迁移行为受到趋化因子的严密调节。1997年Aiuti等人首次发现SDF－1是CD34＋造血干细胞的趋化因子［23］，随后大量的研究不断证实SDF－1在骨髓造血干细胞的迁移中起重要作用，并且发现来源于骨髓，脐血动员的外周血中的CD34＋造血干／前体细胞表面表达其相应受体CXCR4，而SDF－1能特异性地对这些CXCR4＋细胞产生趋化作用。

本研究趋化实验结果证实SDF－1α对小胶质细胞具有趋化作用，在200ng／ml浓度时具有最大趋化效应。进而本研究观察了SDF－1侧脑室注射对WT小鼠的影响。本研究发现，野生型小鼠予以SDF－1α注射后小鼠皮层和海马的小胶质细胞数量明显增多，WB结果也提示SDF－1能提高小胶质细胞在脑内的表达水平，说明在生理情况下细胞因子SDF－1α就能够促进脑内小胶质细胞的增加。形态上SDF－1α干预组与PBS干预组比较并未发现有明显的改变，细胞没有呈现出活化的状态，提示SDF－1对小胶质细胞的功能状态没有明显影响。尽管在这里小胶质细胞的来源有待被清楚的证实，但由于SDF－1对骨髓来源干细胞的强大趋化作用，且生理情况下中枢内并不存在导致小胶质细胞活化和增殖的内源性病理因素，因此本研究猜测SDF－1α侧脑室注射后小鼠脑内小胶质细胞的增加是通过SDF－1α对骨髓来源的干细胞向CNS趋化的促进作用实现的。

目前本研究前期通过对脑缺血、癫痫间及神经退行性疾病等疾病中胶质细胞功能的研究表明，小胶质细胞参与神经损伤后坏死组织清除过程，与神经元生存微环境密切相关，在中枢神经系统损伤后功能重建中发挥重要作用。明确小胶质细胞向病灶趋化的机制和来源可进一步采用有效手段在疾病早期增加小胶质细胞的吞噬清理作用，而在疾病晚期抑制小胶质细胞细胞毒性作用，为治疗CNS疾病提供新的干预措施。

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