一种小鼠心脏取血的改良方法*

常 欢 王 云 韩继举 张 慧 夏作理 高允生 赵晓民

(1.泰山医学院药理学教研室； 2.泰山医学院动脉粥样硬化研究所，山东 泰安 271000)

在有关小鼠血小板黏附、聚集和血液多指标研究中常需要较多血液才能完成。小鼠麻醉后开胸直视心脏下取血，具有容易刺入心脏取血的优点，可以获取一定量的血液[1]。但抽血后期针头容易受血凝块堵塞，从而影响取血量。因而本实验建立一种小鼠心脏取血的改良方法(全身血液肝素化)，分析影响取血量的因素，以期为从小鼠心脏较多取血提供一种参考和依据。

1 材料和方法

1.1材料 实验动物：80只SPF级昆明种小白鼠，雌雄各半，体重19～28 g，购于山东泰邦生物制品有限公司。主要设备和药品试剂：戊巴比妥钠(Merck公司)，肝素钠注射液(上海第一生化药业有限公司)；0.9%氯化钠溶液(山东鲁抗辰欣药业有限公司)。

1.2方法 小鼠随机分为传统心脏取血组(传统取血组)、改良心脏取血组(改良取血组)，n=20(雌雄各半)。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉。记录腹腔注射药物至深反射消失时间，作为麻醉诱导时间。之后迅速仰位固定小鼠，沿剑突至两侧腋窝下剪开胸腔，暴露心脏。记录自开胸起始至结束时间，作为开胸时间。改良取血组：1 ml注射器针头(直径0.4 mm)由小鼠左室快速注射200 U/ml肝素生理盐水(10 ml/kg)，停3～5 s后，2.5 ml注射器针头(直径0.6 mm，200 U/ml肝素生理盐水润洗)直接由右室进针抽血，直至无明显血液取出。传统取血组：只用注射器(肝素生理盐水润洗)自右室进针抽血。记录针头进入右室至抽血结束时间，为取血时间。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，数据以 均数±标准差表示，两组间比较采用t检验。用Pearson或Spearman相关以及多元线性回归法分析取血量与其他因素之间的关系。P≤0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1改良取血法对取血量的影响 与传统取血组比较，改良取血组雄鼠和雌鼠的取血量显著增加(均P<0.001)，但体重、麻醉诱导时间、开胸时间、取血时间无显著性差异。在改良取血组，雌雄鼠取血量、麻醉诱导时间、开胸时间和取血时间均无显著性差异。见表1。

2.2取血量与体重、麻醉诱导时间、开胸时间和取血时间关系 将改良取血法中雌雄鼠作为整体，相关分析结果显示，取血量与体重、麻醉诱导时间呈显著正相关关系(分别P<0.001，P<0.01)，与性别、开胸时间、取血时间无显著相关关系。见表2。以取血量为因变量，体重和麻醉诱导时间为自变量，多元回归分析结果显示：体重和麻醉诱导时间均进入回归方程(分别P<0.01，P<0.05)，回归方程式：y(取血量)=0.440×体重+0.046×麻醉诱导时间。

表1 两种取血方法中体重、麻醉诱导时间、开胸时间、取血时间、取血量的比较(n = 20)

注：*P< 0.001，与传统取血组同性别鼠比较。

表2 血量与体重、麻醉诱导时间、开胸时间和取血时间的相关系数

注：*P<0.01,**P<0.001。

3 讨 论

本实验应用小鼠心脏取血的改良方法，比传统的心脏取血方法可取得更多血液，适合于开展血小板多指标的有关实验。改良心脏取血法技术要点为：抽血前自左室快速注射肝素(200 U/kg)，使全身血液肝素化，随即应用肝素化2.5 ml注射器针头从右室抽血。

心脏取血前需开胸术，开胸为一种创伤，可引起血液高凝，伴有微粒和凝血酶产生增多[2]，若无抗凝药物应用，小鼠体内会有微血栓形成而对取血量和血液成分带来影响。此外抽血时血液接触抽血器具内面，会激活凝血系统[3]，因而若抽血器具内无抗凝药物使用，血液会在抽血器具内形成凝血团块，不但堵塞针头，也会改变血液成分。肝素具有体内抗凝血[4]，故本实验取血的改良方法，应用肝素左室内注射、抽血器具肝素化处理，从而实现顺利抽血和血液成分较少改变的效果。

本实验认为抽血器具以2.5 ml注射器为宜，可以避免因针头内径过细增加血液通过针头的剪切力，引起溶血[5]、凝血系统激活和血小板活化的弊端[6-7]；也可避免针头内径较粗引起右室过多损伤，产生血液回流减少的不利因素。

为了保证从取血的改良方法能够较多量取血，本实验观察了影响取血量的因素，除了体重影响取血量之外，结果还表明：①应用戊巴比妥钠的麻醉诱导时间对取血量有一定影响。选用戊巴比妥钠麻醉的主要原因是，该药对心功能抑制较小、心率降低较轻[8]，能保证左室注射对全身肝素化的效果以及较多血液回流至右心室。麻醉诱导时间影响取血量可能与当麻醉诱导时间较长时，表明小鼠对戊巴比妥钠较为耐受，相对出现心脏抑制、血管扩张的作用较轻、较慢[9]，因而全身肝素化效果较好、回心血量较多，从而使取血量相应增加。②取血量与开胸时间、抽血时间无显著相关关系。开胸后，本实验观察到心脏会持续搏动5 min左右，由于开胸时间不超过35 s，抽血时间不超过130 s，均远低于心脏停止搏动时间，因而二者对取血量影响不大。此外，实验中没有发现性别对取血量的影响，这可能与实验中对雌雄小鼠的处理因素一致有关。

总之，小鼠心脏取血的改良方法可以较多量地取血，体重和麻醉诱导时间为取血量影响因素，为从小鼠较多量取血提供了一种途径，有利于应用小鼠开展血小板黏附聚集和血浆多指标观察。局限性在于不适合于有关血气的研究、动物不能存活、对凝血指标有影响等。

[1] Joslin JO. Blood collection techniques in exotic small mammals[J]. J Exot Pet Med,2009, 18(2):117-139.

[2] Park MS, Owen BA, Ballinger BA,et al.Quantification of hypercoagulable state after blunt trauma: microparticle and thrombin generation are increased relative to injury severity, while standard markers are not[J]. Surgery, 2012,151(6):831-836.

[3] Differding JA, Underwood SJ, Van PY,et al.Trauma induces a hypercoagulable state that is resistant to hypothermia as measured by thrombelastogram[J]. Am J Surg,2011, 201(5): 587-591.

[4] Muriithi EW, Belcher PR, Day SP, et al.Heparin-induced platelet dysfunction and cardiopulmonary bypass[J].Ann Thorac Surg, 2000,69(6): 1827-1832.

[5] Sharp MK, Mohammad SF. Hemolysis in needleless connectors for phlebotomy[J]. ASAIO J,2003,49(1):128-130.

[6] Miyazaki Y, Nomura S, Miyake T,et al.High shear stress can initiate both Platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles[J]. Blood, 1996, 88(9): 3456-3464.

[7] Chen YW, Chen YC, Wang JS. Absolute hypoxic exercise training enhances in vitro thrombin generation by increasing procoagulant platelet-derived microparticles under high shear stress in sedentary men[J]. Clin Sci (Lond),2013, 124(10):639-649.

[8] Janssen BJ, De Celle T, Debets JJ, et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(4):H1618- 1624.

[9] 范礼理，孙丽红，孙卓前，等.羟苯氨酮对戊巴比妥钠致心力衰竭的治疗作用[J].药学学报,1999,34(2):103-108.