疑似感染猪圆环病毒2型病例的确诊

2014-06-07周升绪山东省诸城市畜牧兽医管理局262200

山东畜牧兽医 2014年9期

周升绪（山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

疑似感染猪圆环病毒2型病例的确诊

周升绪（山东省诸城市畜牧兽医管理局 262200）

山东省诸城市某猪场送检了一起临床疑似感染猪圆环病毒2型的仔猪，临床表现为消瘦，腹部甚至全身皮肤表面有硬币大小的斑块；呼吸急促困难；个别仔猪存在腹泻。通过临床剖检发现全身淋巴结肿大，切面白色多汁；肝硬变；肺脏肿胀间质增宽；肾脏水肿，苍白，被膜下有大小不一的白斑，髓质部有点状出血。分别采集病猪腹股沟淋巴结、部分肺脏和部分肾脏研磨后取上清，行了PCR鉴定。根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型基因序列设计合成的一对引物，经过PCR鉴定，扩增片段与目的片段大小相符，进一步证实该猪场的病猪感染了猪圆环病毒2型病毒。德国人于1974年在PK-15细胞系中发现了一种与细小病毒类似的颗粒，当时被认为是一种细胞污染物。1982年，有人通过对这种细胞污染物进行提纯镜检及核酸鉴定，最后确定为一种新的病毒，并命名为猪圆环病毒(PCV)。根据圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将PCV划分无致病性的PCV1和有致病性的PCV2两个基因型。PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征密切相关，PCV2主要侵害机体得免疫系统，能造成免疫抑制，常常与PRRSV 、PPV等造成混合感染，严重影响猪体的健康及生产性能。目前我国许多地区都有PCV2存在，该病给我国及世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失，被世界公认为重要的猪传染病。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料取病变典型的病猪肺脏腹股沟淋巴结、部分肺脏以及部分肾脏，于-20℃ 保存备用。

1.1.2 主要试剂 DL-2000 DNA Marker(购自大连宝生物生物工程有限公司)、蛋白酶K、饱和酚、琼脂糖等(购自金博生物技术有限公司)，其它试剂均为进口或国产分析纯品。

1.1.3 主要仪器 DYY-2型琼脂糖凝胶电泳槽(北京六一仪器厂)、凝胶成像系统(Alpha Innotech公司)、2A200型电泳仪(Amersham公司)、生物安全柜(苏净集团安泰公司)、超纯水(自宝生物工程有限公司)、DTC-200型PCR仪(MJ Reaserch 公司)、BCD-251型冰箱(Hisense公司)、移液枪(Eppendorf公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 根据NCBI上发表的PCV2全基因序列，参照Fenaux等设计1对引物: PF、PR用于扩增PCV2全基因序列，引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。PF：TGTCCGCGG GCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA，PR：GCCCGCGG AAATTTCTGACAAACGTTACA。

1.2.2 对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA 取称取病死猪的腹股沟淋巴结各0.5g于研钵中，用剪刀剪碎，加入2.0mlPBS缓冲液，研磨。取研磨液500μl于1.5ml离心管中，按终质量浓度为20mg/L蛋白酶K、1%SDS 56℃消化2h，然后用等体积的酚：氯仿(1:1)抽提组织中的总DNA，最后用2倍体积的冷无水乙醇沉淀DNA，并将DNA溶解在100μl灭菌超纯水中，其后取2μl作为PCR反应模板。

1.2.3 利用设计的PCR引物，以上述DNA为模板进行PCR扩增 PCR 扩增条件为：预变性95℃ 9min，94℃变性1min，48℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环后，72℃延伸10min。取5μl PCR产物在10g/L的琼脂糖凝胶上电泳检测。

2 试验结果

2.1 临床症状及剖检病变

通过观察送检疑似感染猪圆环病毒2型的病猪，临床上主要表现为消瘦，腹部皮肤表面有硬币大小的斑块，呼吸急促困难。剖检发现该病最明显的病变是淋巴结肿大、肝硬变、多灶性黏液肿性支气管炎，肠、胃、回盲瓣黏膜有出血，肺脏外观灰色至褐色呈斑驳状，质地似橡皮，脾肿大、坏死色暗，肾苍白、肿大、有坏死灶，心包炎，胸腔积水并有纤维素性渗出。

2.2 PCR鉴定结果

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，阳性对照及送检样品在703bp处均出现目的条带(附图)，与预期结果相符。确诊该病猪感染猪圆环病毒2型。