帕金森病患者脑脊液中miR-9a的表达及其临床意义

张 宏朱政峰李 辉

（1 兰州军区空军机关医院神经内科，甘肃 兰州 730000；2 兰州军区空军机关医院医务处，甘肃 兰州 730000）

帕金森病患者脑脊液中miR-9a的表达及其临床意义

张 宏1朱政峰2李 辉1

（1 兰州军区空军机关医院神经内科，甘肃 兰州 730000；2 兰州军区空军机关医院医务处，甘肃 兰州 730000）

目的研究miR-9a在帕金森病（PD）患者脑脊液中的表达，为帕金森病的早期诊断提供临床检测指标。方法采用实时荧光定量PCR检测42例PD患者、24例普通头痛患者和24例健康人脑脊液中miR-9a表达水平情况。分析脑脊液中miR-9a表达水平与PD相关临床指标的关系。结果PD组患者脑脊液中miR-9a表达水平明显高于头痛组和健康对照组（P<0.05），且PD患者脑脊液中miR-9a表达与帕金森综合评分量表（UPDRS）分级呈正相关（r=0.70，P<0.05）。ROC曲线确诊PD患者的脑脊液miR-9a临界值为0.667，其诊断敏感度为85.7%，特异度为77.9%。结论脑脊液miR-9a的检测不仅有助于PD的诊断，也可能作为判断PD病情的指标之一。

帕金森病；脑脊液；miR-9a；生物标志物

帕金森病（Parkinson disease，PD）是以黑质纹状体系统多巴胺能神经元进行性变性缺失和Lewy小体出现为特异性改变，好发于中老年人，其病因和发病机制至今尚未完全明确[1]。流行病学调查显示，我国50 岁以上人群中 PD 的患病率约为1%。由于PD患者可出现严重的运动功能障碍，如震颤、强直及动作迟缓，严重者生活不能自理，给社会和家庭带来沉重的负担[2]。目前临床上对于PD的诊断只能依靠患者临床症状，而当患者出现明显的临床症状时，神经元损害往往已经达到了不可代偿的阶段。因此，寻找一种可靠的、能早期诊断并跟踪疾病进展的生物标志物，已成为目前研究PD的热点。最近的研究表明，人的体液中存在稳定表达的miRNAs。且PD患者脑脊液中miRNAs的表达与正常人存在比较明显的差异[3]。有报道脑组织中miR-9a的表达与神经系统发育和神经系统相关疾病密切相关。但脑脊液miR-9a能否作为PD诊断及病情评估的标志物尚不清楚。本研究通过检测PD患者脑脊液中的表达水平，探讨miR-9a在PD的临床诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象：选取2009年10月至2013年10月在我院神经内科住院的42例原发性PD患者为PD组。所有PD 患者的诊断均符合全国锥体外系疾病讨论会制定的PD诊断标准，并且排除其他脑变性疾病。UPDRS分级Ⅰ～Ⅲ。其中男性26例，女性16例；年龄57～77岁，平均（64.6 ±7.8）岁；病程2～6年。头痛组为24例主诉头痛患者，均排除脑血管疾病、神经系统感染和肿瘤等器质性病变。其中男性9例，女性15例，平均年龄（55.4±7.2）岁。健康对照组为24例健康人，其中男性12例，女性12例，平均年龄（50.7±6.4）岁。所有受试者及其家属均被明确告知且签署知情同意书。

1.2 主要设备和试剂：Trizol 试剂（Invitrogen公司）；TaqMan MicroRNA Assay和mirVana™ miRNA Isolation Kit（Ambion公司）；ABI PRISM 7900 实时荧光定量PCR仪（ABI公司）；NanoDrop® ND-3300微量分光光度仪（ThermoFisher公司）；miR-9a及U6引物序列购于北京天根生物工程有限公司。

1.3 脑脊液采集：所有受试者均采取腰椎穿刺的方式收集脑脊液。患者取侧卧位，在局麻下行腰椎穿刺，经检测颅内压无升高或降低，椎管无阻塞后。取无色清亮脑脊液约5～6 μL，室温下1500 rpm/min离心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱待测。

1.4 RT-PCR：①Trizol法提取脑脊液RNA，NanoDrop® ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测定RNA浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。mirVana™ miRNA Isolation Kit总RNA中分离出miRNA。②cDNA合成：按RT-PCR反应试剂盒操作步骤制备10 μLRT反应体系：mirVana5×RT Buffer 2 μL，1×mirVanaRT Primer 1 μL，Arrayseript Enzme Mix 0.4 μL，25 ng RNA，加无RNA酶水至总体积10 μL。在GeneAmp PCR System 9700进行逆转录反应：16 ℃ 30 min， 42 ℃ 30 min，83 ℃ 5 min。反应结束后，冰浴冷却，-80 ℃保存。③Realtime PCR反应：采用TaqMan MicroRNA Assays，以U6为内参基因，建立20 μL反应体系：Product from RT reaction 1.33 μL，Taqman MicroRNA Assay（20×）1 μL，Taqman 2×Universal PCR Master Mix 10 μL，Nuclease-free water 7.67 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，（95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s）共40个PCR循环。采用2-ΔΔCT法分析miR-9a表达相对水平情况。

1.5 统计学处理：应用SPSS 13.0统计学软件包对数据进行统计分析。采用采用独立样本t检验，Sperman等级相关分析评估脑脊液miR-9a表达水平与UPDRS分级之间的相关性，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组脑脊液miR-9a表达水平比较：健康人脑脊液中miR-9a表达水平较低（0.25±0.04）；头痛组脑脊液中miR-9a表达水平为（0.26± 0.07），与健康组相比无明显差异（P>0.05）。PD组患者脑脊液中miR-9a表达水平相对值为（1.38±0.37），明显高于健康对照组和头痛组（P<0.05）（图1）。

图 1 不同组脑脊液miR-9a表达水平

2.2 脑脊液miR-9a表达情况在诊断PD上的效能评价：以脑脊液中miR-9a表达水平相对值为检测变量，以分组为状态变量，建立ROC曲线。结果显示，脑脊液miR-9a诊断PD的ROC曲线下面积AUC为0.815。通过计算确定miR-9a诊断PD的最佳临界值为0.667，在此临界值下的诊断敏感度为85.7%，特异度为77.9%（图 2）。

图 2 ROC曲线

2.3 脑脊液miR-9a与PD组各因素之间的相关性分析：由表1可见，Sperman相关性分析显示PD患者脑脊液miR-9a水平与年龄、病程无相关性（P>0.05），而与UPDR分级呈正相关（P<0.05）。

表1 miR-9a与PD组各因素相关性分析

3 讨 论

PD的发病机制十分复杂，目前尚不十分清楚，可能主要由于黑质-纹状体多巴胺能神经通路变性和Lewy小体的形成导致DA能神经元减少。由于PD发病隐匿，早期脑组织无明显影像学改变，待神经功能障碍症状时病变损害已不可逆转。因此，早期诊断对于PD的治疗具有非常熏要的临床意义。

目前的研究证实，脑脊液的生化改变能够反映大脑病理改变，因而在诊断神经变性疾病方面较血清学更具敏感性和特异性。且由于受脑组织取材的限制，因此通过检测脑脊液中PD相关生物学标志物是早期诊断PD的最佳途径[4]。近年来，脑脊液中PD相关生物学标志物的研究已取得较大的进展。如黄嘌呤、尿酸、β2苯乙胺、α-Synuclein蛋白、超氧化物歧化酶等脑脊液分子生物学指标都被证实与PD的发生有关，且有成为PD生物标志物的潜能[5]。但是，以上标志物在诊断PD的敏感度和特异度上尚存在不足。

miR-9a是近年来发现的在哺乳动物脑组织中高度表达的miRNA，且其核苷酸100%保守。研究发现miR-9a在果蝇感觉器官前体细胞（SOP）中表达极其低下而在其临近上皮细胞中呈高表达。提示miR-9a可能对感觉神经元发育成熟和功能加以调控。且miR-9a可以通过调控SOP向感觉神经元分化过程中必需的转录因子，进而使SOP细胞向感觉神经细胞分化[6]。最近Lukiw研究发现阿尔茨海默病（AD）患者海马内miR-9表达水平明显上调[7]。以上研究提示miR-9a与神经系统地发育和疾病的发生密切相关。因此，miR-9a在脑脊液的研究可能有利于为我们阐明PD的具体发病机制，也为早期诊断PD提供了一个潜在的标志物。

本次研究我们采用RT-PCR检测PD患者、头痛患者和健康人脑脊液中miR-9a表达水平，发现PD患者脑脊液中miR-9a表达水平明显高于头痛组和健康对照组（P<0.05）。同时，我们利用ROC曲线确定了脑脊液中miR-9a在诊断PD上的效能，发现脑脊液miR-9a诊断PD的ROC曲线下面积AUC为0.815。通过计算确定miR-9a诊断PD的最佳临界值为0.667，且在此临界值下的诊断敏感度为85.7%，特异度为77.9%。提示脑脊液中miR-9a的高表达可以作为PD的诊断指标，且具有较高敏感度和特异度。此外，通过Sperman等级相关分析，PD患者脑脊液中miR-9a表达水平与患者年龄、病程无相关性（P>0.05），而与UPDR分级呈正相关（P<0.05）。提示可以通过检测PD患者脑脊液中miR-9a表达水平来推测PD损伤程度。

综上，本次研究结果提示脑脊液miR-9a可能成为新的PD诊断及判断病情的标志物，其具有较高敏感度和特异度。随着对miRNA在神经疾病领域内的研究，miRNA将会成为PD疾病一个新的诊断和治疗靶点。

[1] Dexter DT,Jenner P.Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms[J].Free Radic Biol Med,2013,62(1):132-144.

[2] 帕金森病诊疗指南[J].中国临床医生,2010,38(2):77-79.

[3] Machida A,Ohkubo T,Yokota T.Circulating microRNAs in the cerebrospinal fluid of patients with brain diseases[J].Methods Mol Biol,2013,1024(1):203-209.

[4] Shi M,Bradner J,Hancock A M,et al.Cerebrospinal fluid biomarkers for Parkinson disease diagnosis and progression[J].Ann Neurol, 2011,69(3):570-580.

[5] Ascherio A,Lewitt P A,Xu K,et al.Urate as a predictor of the rate of clinical decline in Parkinson disease[J].Arch Neurol,2009,66 (12):1460-1468.

[6] Li Y,Wang F,Lee J A,et al.MicroRNA-9a ensures the precise specification of sensory organ precursors in Drosophila[J].Genes Dev, 2006,20(20):2793-2805.

[7] Lukiw W J.Micro-RNA speciation in fetal,adult and Alzheimer's disease hippocampus[J].Neuroreport,2007,18(3):297-300.

R744

B

1671-8194（2014）36-0166-02