外源菌群煤生物气化初步研究:菌群结构、煤种及煤孔(裂)隙

王保玉,陈林勇,邰 超,3,韩作颖,关嘉栋,赵 晗

(1.中国矿业大学(北京)地球科学与测绘工程学院,北京 100083;2.国家能源煤与煤层气共采技术重点实验室,山西 晋城 048204;3.河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000)

外源菌群煤生物气化初步研究:菌群结构、煤种及煤孔(裂)隙

王保玉1,2,陈林勇2,邰 超2,3,韩作颖2,关嘉栋2,赵 晗2

(1.中国矿业大学(北京)地球科学与测绘工程学院,北京 100083;2.国家能源煤与煤层气共采技术重点实验室,山西 晋城 048204;3.河南理工大学资源环境学院,河南焦作 454000)

以河南义马煤矿、山西山阴煤矿和双柳煤矿不同煤阶煤为研究对象,利用沼液经逐步驯化得到的外源产甲烷菌群为菌源,在千克级的水平上进行了煤生物气化模拟实验。采用16S rDNA测序对驯化得到的菌源进行初步确定,并研究了驯化菌源对不同煤种的气化效果,采用扫描电镜初步研究了驯化微生物形态与煤孔(裂)隙的可能作用。结果表明,不同煤样外源菌群煤生物气化均存在产气周期,可分为快速、缓慢和抑制3个阶段,而不同煤种气化阶段存在明显差异。16S rDNA测序结果显示,甲烷丝状菌属(Methanothrix)占0.02%,而典型的和煤的骨架芳香结构降解相关的微生物类群占约8%,表明降解步骤是煤生物气化的速控步骤。扫描电镜观察发现,驯化后的菌群以球状和杆状为主,部分微生物进入煤的孔裂隙。当以块状煤为底物长期驯化菌源时,菌群的产气效率明显降低。

煤;微生物成气;菌群结构;煤种;煤孔隙;菌群活性

利用生物作用把煤转变成气体燃料(例如甲烷)的技术,被称为“煤生物气化”,是煤炭综合加工利用的一种新的尝试和努力,尽管距离其最终目标实现煤的地下生物气化尚有一定的距离,但与传统的煤气化技术相比,该技术低能耗、绿色、环保,具有探索的价值。Scott等的研究表明,次生生物气是煤层气的一个重要来源[1],说明煤具有生物气化的潜力。近年来,生物成因煤层气越来越受到国际煤层气领域的关注[2],针对煤生物气化的研究,从菌源来看可以分为外源产甲烷菌群和煤层天然本源微生物,两种来源的微生物均可实现煤的气化[3-7]。

笔者以河南义马煤矿、山西山阴煤矿和双柳煤矿不同煤阶煤为研究对象,利用自制沼液经逐步驯化得到的外源产甲烷菌群为菌源,在千克级的水平上进行了煤生物成气模拟实验。采用16S rDNA测序对驯化得到的菌源进行初步确定,并研究了驯化菌源对不同煤种的气化效果,采用扫描电镜初步研究了驯化微生物形态,探讨了煤孔(裂)隙的可能作用。

1 实验方案

1.1 煤样与菌群

实验用煤样采自河南义马煤矿、山西大同山阴煤矿、吕梁双柳煤矿,块状煤直径5～15 cm,堆放半年以上,煤工业分析结果见表1。可以看出,从挥发分产率(Vdaf)看,义马和大同的煤样煤阶要低于吕梁煤样。

表1 煤样的工业分析结果Table 1 The proximate analysis of coal sample %

秸秆采自山西晋城市田间,将义马煤样进行粉碎,对其中85～100目的煤粉进行气化实验,大于100目的煤粉用于菌群的驯化实验。厌氧菌群采用实验室自制的小型沼气池的沼液进行驯化。

1.2 营养液

1 L纯水中加入抗坏血酸0.5 g,EDTA 0.5 g,酵母粉2 g,K2HPO42.9 g,KH2PO41.5 g,NH4Cl 1.8 g, MgCl20.4 g,微量元素液100 μL,维生素液50 μL。

微量元素:FeSO4·7H2O 21 g;ZnCl20.7 g; MnSO4·H2O 1 g;CoCl2·6H2O 1.9 g;CuSO4·5H2O 0.03 g;NiCl2·2H2O 0.24 g;Na2MO4·2H2O 0.36 g; KAl(SO4)20.1 g;H3BO30.06 g;纯水100 mL。

维生素:硫辛酸0.05 g,维生素B12 0.001 g,盐酸吡多辛0.1 g,生物素0.02 g,烟酸0.05 g,叶酸0.02 g,D-泛酸钙0.05 g,对氨基苯甲酸0.05 g,纯水100 mL。

1.3 实验方法

1.3.1 厌氧菌群驯化

将500 g采集的秸秆切碎,长度约为5 cm,用清水冲洗掉其上的泥土等残渣后装入18 L密闭容器,加入10 L培养基,500 g新鲜猪粪,曝氮气30 min,密封,8 d后,以大于100目的褐煤煤粉为底物进行逐步驯化[8-9],得到实验用厌氧菌源。

1.3.2 微生物基因组提取及16S rDNA扩增测序

DNA的提取采用试剂盒(EZNA water DNA kit), 16S rDNA V6高变区片段扩增引物为V6-F(5’-CAACGCGARGAACCTTACC-3’),V6-R(5’-CGACAGCCATGCANCACCT-3’)。PCR扩增反应体系为:TaKaRaEx Taq Buffer(含镁、含dNTPs)25 μL,引物(10 μmol/L)各1.5 μL,模板2 μL,加无菌水至50 μL。PCR反应条件为:94℃预变性3 min,98℃变性10 s,57℃退火30 s,72℃延伸30 s,共31个循环,最后在72℃延伸2 min。PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,测序由深圳华大基因科技服务有限公司完成。

1.3.3 生物成气模拟实验

在140 L自制发酵罐中,进行生物成气模拟实验。其中,煤样30 kg,加入60 L营养液,曝氮气30 min,用蠕动泵泵入10 L驯化液,再曝气10 min。发酵罐温度35℃,用5 L气袋收集产生的气体,用气相色谱进行气体成分分析。

1.3.4 生物作用后煤样的扫描电镜观察

取微生物作用后的大小合适的煤块,利用25%, 50%,75%,95%的乙醇对其上的微生物进行梯度脱水后[10]利用扫描电镜观察。

1.3.5 不同时间驯化液活性实验

发酵罐模拟产气约28 d为一个周期,30 kg义马煤块每完成一个产气周期,将30 L驯化液排出,重新补加等量的营养液,作为菌源随时取用。在100 mL厌氧瓶中,加入1.5 g的85～100目义马煤粉,57 mL营养液,曝气1 min后放入DWS厌氧工作站,接种1个月的驯化液5 mL,35℃恒温培养,每隔4～5 d取气体样品测量甲烷含量,实验结束后将厌氧瓶中的气体导出。以第12个月的驯化液为菌源重复实验。

1.3.6 气体成分测定

仪器选用美国Angilent 7890气相色谱仪,配Carbonplot色谱柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和TCD检测器,气密针进样,进样量0.5 mL。色谱进样口温度150℃,柱温箱温度25℃,检测器温度200℃。

2 实验结果分析

2.1 微生物16S rDNA测序结果分析

驯化液的测序结果显示微生物主要分布在细菌域(82.44%),少数分布在古菌域(0.02%),还有部分不确定(17%)。古菌域的0.02%全部是甲烷丝状菌(Methanothrix)。在检测到的细菌域20个门(Phylum)中,变形菌门(Proteobacteria)占22.93%,厚壁菌门(Firmicutes)占18.11%,螺旋体门(Spirochaetes)占10.98%,拟杆菌门(Bacteroidetes)占10.42%,放线菌门(Actinobacteria)占2.17%,硝化螺菌门(Nitrospira)占1.23%,其他菌门占比均小于1%(图1)。变形菌门的鞘氨醇菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)(2.08%)、互营杆菌属(Syntrophobacter)(0.25%)、不动杆菌属(Acinetobacter)(0.76%)等,放线菌门的分枝杆菌属(Mycobacterium),诺卡氏菌(Nocardia)(0.08%)等,拟杆菌门的黄杆菌属(Flavobacterium)(0.12%)等,厚壁菌门的芽孢杆菌属 (Bacillus)(0.12%)、梭 菌 属 (Clostridium) (3.15%)等,在多环芳烃等难降解有机物的生物降解中起重要用[11-15],硝化细菌可促进水中溶解性含氮物质的转化[16-17],螺旋体门的螺旋体属可降解碳水化合物产生乙醇、乙酸、乳酸、氢气和二氧化碳[18-20]。

图1 驯化液菌群结构Fig.1 Bacteria communities of the domesticated microbes

煤的生物降解多基于煤的基本结构单元含类木质素、芳环和一些官能团[20-23],煤的降解结果也显示其芳环缩合度降低,脂肪链断裂,含氧官能团减少[24]。驯化液中含有产甲烷必要的菌群,典型的产甲烷菌群占整个菌群比约8%。甲烷丝菌属仅占0.02%可能有两方面原因:①产甲烷菌是产甲烷生物链上的最后一个环节,不是速控步骤;②PCR扩增的引物是细菌的通用引物,对古菌的扩增效果不理想。

2.2 生物气化模拟实验结果

研究表明,无烟煤中的天然产甲烷菌群产气可达到85 d[5]。褐煤中的天然产甲烷菌群的一个产气周期为55 d左右,一个产气周期又可以分为生气量缓慢增长、显著增高、趋于减缓3个阶段[4],这与本研究中实验室模拟的外源产甲烷菌群产气规律不同,外源产甲烷菌群的产气周期较短,一般在28 d左右(图2,图中百分数代表甲烷含量)。原因可能有两方面:①上述文献中的煤为粉末状,比表面积大,有利于微生物的作用;②经过驯化的外源产甲烷菌群对煤的降解效果比天然产甲烷菌群强,降解速度较快。

图2 不同煤样成气效果Fig.2 The gas production of different coal samples

从图2可以发现,3种煤样的产气均可以分为3个阶段:产气速率快速增高、缓慢升高、趋于停止。义马煤样第1阶段为0～7 d,第2阶段为8～21 d,第3阶段为22～28 d。大同和吕梁煤样第1阶段为培养开始至6～10 d,第2阶段为11～21 d,第3阶段为22～28 d。

快速成气阶段的出现可能与微生物培养基中的有机质有关,培养基中的相对于煤来说分子结构简单,易于被微生物利用,实现了第1阶段的的快速产气。而在第2个阶段中,微生物开始利用煤中可降解的部分产气,直到第22天产气基本停止,其原因可能是因为微生物的代谢产物积累,产生了反馈抑制。

值得注意的是,煤阶较高的吕梁和大同煤样气化的第1阶段末期即6～10 d出现了相对平稳的阶段,这可能是由于相对于低阶煤,较高阶煤降解需要较长的时间。有关煤生物成气特征与煤炭基质及微生物来源方面的关系尚需进一步研究。

2.3 微生物作用后煤样的扫描电镜观察

生物气化是一个由多种微生物构成的菌群共同完成的过程。如图3所示,菌群以球状和杆状微生物为主。图3(a)中的杆菌长为 1.899 μm,直径为736.9 nm;图3(b)中的两个球菌直径分别为742.3和737.2 nm;图3(c)中的裂隙宽度为2.072 μm,孔隙直径为 744.8 nm;图 3(d)中的球菌直径为915.5 nm,裂隙宽度为2.539 μm。

图3 微生物处理后煤表面微生物Fig.3 Representative SEM micrographs of coal and microbes on the coal surface

可以发现:①部分微生物可进入煤中的一些孔隙;②孔隙占煤体积的比例小。现有的理论认为,难降解的高分子物质能被微生物降解的前提是能与微生物或其胞外酶接触。因此,与相同质量的煤粉相比,以块状煤为底物时比表面积小,对于微生物来说有效基质量就少。当能与微生物接触部分的营养物质被利用完,而煤块内部的营养物质不能被利用时,产气周期就有可能结束,以此时的块煤作为底物驯化外源产甲烷菌群时,菌源的活性可能降低。

2.4 不同时间驯化液活性实验结果

以义马煤为研究对象,对驯化时间对驯化液产甲烷活性的影响进行了初步研究,结果如图4所示。从图4(a)可以看出,在初始驯化阶段实验组甲烷含量的上升明显高于对照组,且实验组的甲烷终含量为25.5%,也高于对照组16.6%。实验结束后将厌氧瓶中的气体导出,实验组导出气体61 mL,对照组导出37 mL。说明外源产甲烷菌群可以利用褐煤煤粉产气。

如图4(b)所示,以12个月的驯化液为菌源时,实验组与对照组的产气速率差别不大,甲烷终含量实验组为29.4%,对照组为30.5%,对照组略高于实验组,且两组均未能从厌氧瓶中导出气体。

图4 驯化初、末期驯化液成气效果Fig.4 The gas production by the tail domestication microbes

两组实验所用的底物及营养液相同,菌源不同。出现不同结果的原因可能是:随着发酵时间的延长,可提供营养物质的煤的有效基质基本被完全消耗,驯化得到的可以降解煤的部分微生物逐渐失去了优势,第12个月驯化液中的菌群只能利用营养液,煤粉的存在甚至部分抑制了微生物对营养液的利用。

3 结 论

(1)外源产甲烷菌群进行块煤的生物气产出模拟时,产气周期为28 d左右;培养开始至7～10 d为产气周期的第1个阶段,微生物利用营养液产气。第1阶段末期至产气的21 d为第2阶段,微生物利用煤产气,22～28 d,产气趋于停止。

(2)利用驯化的菌源降解煤产气,其驯化液中含有典型的产甲烷菌群;部分微生物可以进入煤的一些孔隙结构,因此煤的孔隙结构决定了煤有效基质的量,对产气速率和产气量有重要影响。

(3)块状煤驯化的菌液到第12个月菌源活性降低。原因在于煤块的有效部分是其外表面及孔隙部分,有效基质被利用完后,不经过处理的块煤不能再用于产气或微生物驯化。

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A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria: Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture

WANG Bao-yu1,2,CHEN Lin-yong2,TAI Chao2,3,HAN Zuo-ying2,GUAN Jia-dong2,ZHAO Han2

(1.College of Geosciences and Surveying Engineering,China University of Mining and Technology(Beijing),Beijing 100083,China;2.State Energy Key Laboratory of Joint Exploitation of Coal and Coal-bed Methane,Jincheng 048204,China;3.Institute of Resources and Environment,Henan Polytechnic University,Jiaozuo 454000,China)

With the coal samples from Yima in Henan Province,Shanyin in Shanxi Province and Shuangliu in Shanxi Province,the biological coal gasification by exogenous bacteria were studied at the kilogram levels.The microbiome composition was identified by 16S rDNA method.Morphology of microorganisms and the interaction of microorganisms and coal were investigated by scanning electron microscope.The results show that the biological coal gasification by exogenous bacteria can be divided into three stages:a rapid growth stage,a stable stage,and an inhibition stage.There are apparent differences at the three stages between the different coal samples.16S rDNA sequence analysis show that Methanothrix accounts for only 0.02%,while other typical microorganisms related to degradation of coal account for 8%.Scanning electron microscope observation show that the microorganisms are mainly spherical and rod-shaped.Some of the microorganisms can enter the coal fissure/pore,which account for a small proportion of coal.With the lump coal for thesubstrate long-term domestication bacterium source,the gas efficiency of bacteria obviously decreases.

coal;biogenic gas;microbiome composition;coal type;fissure;microbial activity

TQ53;P618.11

A

0253-9993(2014)09-1797-05

2014-05-02 责任编辑:毕永华

山西省煤层气联合基金资助项目(2013012016,2012012013);河南省基础与前沿技术研究计划资助项目(122300410241)

王保玉(1960—),男,河南周口人,高级工程师。Tel:0356-2689298,E-mail:wbyjmjt@163.com。通讯作者:邰 超(1978—),男,河南南阳人,副教授。Tel:0356-2689298,E-mail:taichao@126.com

王保玉,陈林勇,邰 超,等.外源菌群煤生物气化初步研究:菌群结构、煤种及煤孔(裂)隙[J].煤炭学报,2014,39(9):1797-1801.

10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009

Wang Baoyu,Chen Linyong,Tai Chao,et al.A preliminary study of biological coal gasification by exogenous bacteria:Microbiome composition,coal type,pore and seam fracture[J].Journal of China Coal Society,2014,39(9):1797-1801.doi:10.13225/j.cnki.jccs.2014.8009