SRB菌的分离鉴定及其对矸石山酸性废水的处理

唐婕琳,何 环,张文娟,洪芬芬,张淑雅,孙 梦,陶秀祥

(1．中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221116;2．中国矿业大学煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室,江苏徐州 221116)

SRB菌的分离鉴定及其对矸石山酸性废水的处理

唐婕琳1,何 环2,张文娟1,洪芬芬2,张淑雅1,孙 梦1,陶秀祥2

(1．中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221116;2．中国矿业大学煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室,江苏徐州 221116)

为了得到煤矸石山酸性废水处理的专属功能微生物,从湖南湘潭某煤矸石山周边土壤中分离筛选硫酸盐还原菌,分析菌株的16S rRNA基因序列,形态和生理生化特性,并利用得到的菌株处理矸石山酸性废水。16S rRNA基因序列分析表明,所分离得到的硫酸盐还原菌株S-7与Desulfuromonas alkenivorans同源性达到99．0%。该菌株为杆状稍有弯曲,能运动,大小(0．5～0．8)μm× (3．0～4．0)μm,革兰氏染色显阴性,最适生长温度为30℃,最适pH值范围6～8,酵母粉为最好的碳源和氮源,硫酸钠为最适合硫源,菌株经培养96 h后细胞浓度高达1．76×109个/mL。培养初始pH为7时,6 d可去除体系中90%硫酸根离子,而不同硫酸根离子浓度对菌株生长和硫酸盐去除效率影响不明显。S-7菌株对矸石山酸性废水中Fe,Mn,Pb和Zn四种重金属离子均存在处理效果,整体上去除效率为Pb＞Fe＞Zn＞Mn,其中Pb离子经7 d处理后去除率达到100%。

硫酸盐还原菌;煤矸石山;酸性废水;重金属离子

Key words:sulfate-reducing bacteria(SRB);coal gangue dump;acid mine drainage;heavy metal ions

煤炭开采利用过程中煤系及其伴生矿物都被当作矸石排放,煤矸石经淋溶形成的酸性废水(acid mine drainage,AMD)是矿区主要的污染源之一,具有酸度大、重金属浓度高以及含大量硫酸盐等特点[1-2]。煤矸石山酸性废水常用的处理方法有中和沉淀法、粉煤灰吸附法、人工湿地综合处理法、功能微生物修复等[3-4]。硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacterium,SRB)是指一类具有能把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、连二亚硫酸盐等硫氧化物以及元素硫还原成硫化氢这一生理特性的细菌的统称,目前已报道的SRB共有18个属,40多个种,它们广泛存在于由微生物分解作用造成的缺氧水陆环境中[5-6]。利用SRB处理煤矿酸性废水具有成本低,适用性强,无二次污染,而且还可回收某些重要的金属硫化物特点,已经在矿山酸性废水治理研究中得到较多关注。胡振琪等[7]利用黄土中分离得到SRB菌株修复矸石山硫污染,发现经微生物处理后,矸石浸液中硫酸根最高转化率可达95．5%,其pH值明显升高,而氧化还原电位和电导率均降低。方迪等[8]研究了小型CSTR反应器中硫酸盐还原菌对人工酸性重金属废水的处理,发现pH=2．6～4．3条件下,硫酸盐还原菌对重金属均具有较好的沉淀效果。也有研究人员利用含有稻草和SRB的活性污泥的生物反应器来回收酸性废水中的Cu2+和Zn2+,发现两种金属离子的回收率分别达到97%和87%[9]。由于酸性矿坑水pH较低,大多处于3以下,因此筛选得到能够在酸性条件下具有硫酸盐还原能力的菌株是当前酸性矿坑水治理研究中的热点。马保国等[10]从煤矸石山淋溶水长期污染的黄土中分离获得一株硫酸盐还原菌,研究发现该菌对硫酸盐转化率最高达94．3%。也有研究人员从酸性矿坑水的沉积物中筛选得到 SRB菌株[11]。本文从矸石山周边酸性土壤中筛选出一株SRB菌株,首先对其分子生物学特性和生理生化性质进行了分析,然后利用该菌株处理煤矸石山形成的AMD重金属废水。

1 材料与方法

1.1 样品采集和菌株筛选

土壤样品取自湖南湘潭某煤矸石山周边土壤,土壤pH为4．23。菌株筛选和分离参照文献[10,12]中所描述方法进行。

1.2 菌株的分子生物学鉴定

采用试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit,DP302-02)提取菌株总基因组,采用细菌通用引物和扩增程序[13]对菌株16S rRNA进行 PCR扩增(Biorad,美国),扩增产物送至上海生工测序公司测序。

1.3 菌株生理生化性质

利用光学显微镜(Nikon,日本)、SEM(JEOL JSM-6360 LV,日本)和TEM(FEI Tecnai G2 20AEM,美国)观察细菌的形态、运动特征,采用常规染色方法对菌株进行革兰氏染色。菌株生长曲线测定:在不添加(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O的基本培养基中,接种1%菌液,初始pH为7．0,30℃下恒温培养9 d,每隔一定时间间隔取样分析OD600和细胞浓度。温度对菌体生长的影响:在测定温度(20,25,30,35,40和45℃)下,接种菌液量1%,初始pH为7．0,厌氧培养4 d后取样分析OD600。初始pH对菌株生长的影响:分别调节培养基初始pH为4．0,5．0,6．0,7．0,8．0的梯度,接种量2%,不加指示剂(NH4)2Fe(SO4)2· 6H2O,培养10 d,每天取样分析。硫酸盐浓度对菌株生长的影响:分别加入硫酸盐浓度梯度为1．0,1．5, 2．5,3．0,4．5 mg/L,接种量1%,恒温培养13 d,每天取样分析。菌株底物利用情况分析:在基本培养基中加入不同碳源、氮源和硫源进行培养,用NaOH调节pH为7．0,培养4 d后取样分析细菌的生长情况。

OD600值用分光光度计分析(UV-2000,北京优尼康),细胞浓度用血小球计数板分析,pH值、ORP值以及残存硫酸根浓度分别用pH计(PHS-3,上海雷磁)、ORP501复合电极 (上海雷磁)和国标(GB 7887—87)测定。

1.4 菌株对矸石山酸性废水中重金属离子的处理试

验

废水样品取自该矸石山所形成的淋溶水,样品呈酸性,pH 为 2．0,暗红色,有刺鼻性气味。经ICP-MS(LA-ICP-TOF-MS,德国)分析,样品中含有较多Fe3+,Pb2+,Zn2+,Mn2+。将500 mL样品过滤(滤膜孔径0．45 μm)后,按4%的接种量接种对数生长期菌液,并加入高温灭菌的酵母膏0．5 g和60%乳酸钠0．25 g,30℃培养。从第3天开始每天取样分析(TAS-990原子吸收光谱仪,北京普析)其中Fe3+, Pb2+,Zn2+和Mn2+浓度。

2 结果与讨论

2.1 菌株分子生物学鉴定

菌株S-7的16S rRNA扩增条带长约1．3 kb,经测序后 Blast分析,该菌株与 Desulfuromonas alken-ivorans具有99．0%同源性,通过软件MEGA5．10采用N-J法绘出菌株S-7的系统发育树(图1),表明该菌株与Desulfuromonas alkenivorans处于同一进化分支上,故将其命名为Desulfuromonas alkenivorans S-7(NCBI的基因登录号为KF182278)。

图1 菌株S-7基于16S rRNA基因序列的系统发育树Fig．1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain S-7

2.2 菌株生理、生化性质

2.2.1 菌株形态学特点

菌株扫描电镜和透射电镜照片如图2所示,菌株S-7为杆状菌稍有弯曲,大小(0．5～0．8)μm× (3．0～4．0)μm,做波浪式扭动运动,革兰氏染色呈阴性。

图2 菌株S-7扫描电镜和透射电镜Fig．2 Scanning and transmission electron micrographs of strain S-7

2.2.2 菌株S-7株生长曲线

由图3可知,菌株S-7在接种后的第1天,OD值和细胞浓度增长相对较缓,推测该时期可能菌株生长的迟缓期;2～4 d时OD值和细胞浓度均急剧上升,显然该时期为菌株对数生长期,4 d后细胞浓度急剧减少,而培养液OD值仍处于缓慢上升期,至第7天基本稳定后缓慢下降。细胞浓度在4 d后就急剧减少可能是由于培养体系中累积的硫化氢对SRB产生抑制所致[13],而细胞浓度下降后OD值仍上升,可能与生长过程中形成的代谢物有关。

图3 菌株S-7的生长曲线Fig．3 Growth curves of strain S-7

2.2.3 温度对菌株S-7株生长的影响

在不同温度下菌株S-7株生长随温度的变化如图4所示。

图4 不同温度对菌株S-7生长的影响Fig．4 Effect of different temperature on the growth of strain S-7

由图4可知,在15℃和45℃时细菌的OD600都小于0．2,S-7菌株在30℃时OD600达到峰值0．6,因此S-7菌株属于中温菌,温度生长范围20～40℃,最适生长温度在30℃左右,且菌株的生长条件受温度影响较大。

2.2.4 培养基初始pH值对菌株S-7生长的影响

由图5(a)可知,不同初始pH值培养菌株经2 d后,pH值均发生变化,其中初始pH值低于6．0的培养液pH均上升,而高于6．0则呈下降趋势,经过2 d培养后所有培养液pH值均稳定在6．5左右,这可能与体系中硫化氢的生成有关,碱性条件下硫化氢起到中和作用,而酸性条件下硫化氢较容易从溶液中释放出来导致pH缓慢上升。整体上看,菌株的ORP均呈下降趋势,6 d后趋于平稳,其值介于-50～-100 mV。其中初始pH值越高,其氧化电位越高,可见ORP受pH值影响较大(图5(b))。菌株在pH= 4～8均能够生长,其最适生长 pH值在6～8(图5(c))。从图5(d)可知,硫酸根的去除率趋势与菌株的生长趋势一致,pH值较低时菌株生长缓慢,硫酸根去除率也相应较低,可见低pH值对菌株的生长和硫酸盐还原存在抑制作用。

图5 不同初始pH值对S-7菌株生长过程中pH,ORP,菌株生长及SO24-去除率的影响Fig．5 Effect of different primary pH values on pH,ORP,strain growth and sulfate removal rate of strain S-7

2.2.5 不同初始SO24-浓度培养基对S-7菌株生长的影响

由图6可知,不同浓度硫酸根离子培养菌株S-7过程中,体系的pH,ORP,OD600和硫酸根离子去除率的变化趋势基本相近,整体上影响不明显,有可能跟该菌株有较强的耐硫酸盐浓度有关。其中,前4 d培养过程中,pH缓慢下降,且硫酸根离子质量浓度较高(4．5 g/L)菌株培养液pH下降相对较少,经第5天急剧上升后又平稳在6．5左右(图6(a))。ORP变化趋势与pH变化趋势基本一致,前4 d也逐渐下降,经第5天上升后最终稳定在-100 mV左右(图6(b))。由此,该菌株培养体系中,pH与ORP保持近正相关关系。图6(c)说明,随着培养过程进行,菌株生长呈上升趋势,且浓度较高硫酸根离子对菌株生长具有一定促进作用。不同浓度硫酸根培养液中硫酸根离子去除率变化趋势与菌株生长基本一致,随着培养过程的进行,去除率逐渐上升,经12 d培养后,体系中硫酸根去除率均达到90%以上,整体上来看,高浓度硫酸根离子对菌株脱除硫酸根效率存在一定抑制作用,这也说明硫酸根并非菌株生长所必需,而仅作为电子受体氧化有机物,提供能量所需。另外,结合图6(a),(b)中菌株pH和ORP值变化趋势推测,第5天体系中pH和ORP变化可能与培养过程中生成硫化氢有关。

图6 不同浓度对菌株S-7生长过程中pH,ORP,菌株生长和去除率的影响Fig．6 Effect of different sulfate concentration on pH,ORP,strain growth and sulfate removal of strain S-7

2.2.6 菌株S-7对不同碳源、氮源、硫源的利用情况

由表1,2中不同碳源、氮源及硫源条件下菌株SRB生长情况可知,菌株S-7菌株能够利用的碳源、氮源和硫源也比较广泛,其中以酵母粉为碳源,蛋白胨、尿素为氮源,硫酸钠、单质硫和硫脲为硫源时生长旺盛。

表1 菌株S-7对碳源的利用情况Table 1 Utilization of carbon sources by the strain S-7

表2 菌株S-7对氮源和硫源的利用情况Table 2 Utilization of nitrogen sources and sulfur sources by the strain S-7

2.2.7 菌株S-7与已分离鉴定部分SRB菌株生理生化特性比较

由表3可知,不同菌属的SRB生理、生化特性存在差异,大多数SRB菌为杆状或弧状,能运动,革兰氏染色多为阴性。尽管有些菌株筛选环境为酸性,但是最适pH接近中性或弱酸性,大多数SRB菌生存温度接近室温。碳源主要是给SRB生长氧化所需的电子供体,最普遍利用的碳源为C3和C4脂肪酸,如乳酸盐、丙酮酸、苹果酸;此外还可以利用一些挥发性脂肪酸,如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐;醇类,如乙醇,丙醇等,并且不同碳源对SRB还原硫酸盐效率也存在影响[2,16]。

目前,国内也有研究人员为了增加利用硫酸盐还原菌治理废水的应用潜力,考虑用一些较廉价碳源来替代传统碳源,如肖丽萍[17]得出鸡粪和木屑混合物的发酵产物可用作SRB菌的碳源。李亚新等[18]研究证明过用有机废弃物和生活垃圾中温发酵产物作为有机碳源也具备可行性。硫源主要作为SRB菌的电子受体存在,硫酸盐均是大多数SRB菌首选的硫源,至于其他含硫基质利用情况因菌株代谢过程不同而存在差异。SRB菌利用的氮源主要是铵盐,也有报道称某些SRB还能够固氮,一些菌种能够利用氨基酸中的氮作为氮源,少数菌种甚至能通过异化还原硝酸盐和亚硝酸盐提供氮[19]。

2.3 菌株S-7对矸石山酸性废水中重金属离子的处理

由图7可知,菌株S-7对酸性废水中的Fe,Mn, Pb和Zn四种离子的去除主要集中在处理前期,通过比较发现菌株对每种离子的去除过程和去除率均存在差异。从离子浓度变化趋势来看,菌株对Fe和Zn的变化趋势接近,在前3 d迅速下降后快速接近平衡,而Mn和Pb离子浓度在前7 d变化趋势较缓。经3 d处理后,Fe和Zn离子的去除率分别达74%和50%(图7(a),(d));而经3 d处理后,废水中Mn和Pb离 子的 去除 速 率分 别为 36% 和 56% (图7(b),(c))。

4种离子中,菌株对Pb离子去除效果最明显, 7 d后去除效率接近100%,而另外3种离子的去除率变化不明显,后期均趋于平稳,整体的去除率为Pb＞Fe＞Zn＞Mn。目前有关SRB去除重金属原因有几种看法,有一部分研究人员认为主要是微生物参与了重金属的吸附[20],也有研究人员认为是酸性废水中丰富的硫酸盐经微生物异化形成的硫化氢后与重金属形成沉淀[8],另也有报道称当体系中存在多种离子时,离子共存对金属离子的去除也存在影响,存在离子共存效应[21-22]。根据目前的处理结果推测菌株S-7对4种离子的去除机制可能存在差异,有可能也存在离子共存效应,其具体原因有待进一步研究。

表3 菌株S-7与目前分离鉴定几株SRB菌株主要特性比较Table 3 Comparison of the major characters between strain S-7 and some other identified SRB strains

图7 S-7菌株处理酸性废水时金属离子浓度变化Fig．7 Changes of metal ions concentration in the acid mine drainage processed by the strain S-7

3 结 论

(1)分离纯化鉴定出一株SRB菌株S-7,16S rRNA基因比对分析表明该菌株与 Desulfuromonas svalbardensis具有99%的同源性,理化性质研究表明该菌株在20～40℃都能较好生长,最适生长温度在30℃左右,对pH值有较强的适应能力,在pH=4～8都能较好生长,最适生长的pH值在6～8。该菌的适应能力强,大多数的有机碳源,氮源和硫源都能供其生长,其中酵母粉是较好的碳源和氮源,硫酸钠为最适合硫源。

(2)不同pH值对硫酸盐去除效率影响明显,在pH值为7时,6 d可去除硫酸根离子90%,而不同硫酸盐浓度对菌株生长和去除硫酸盐影响不太明显,整体上看,培养体系中的pH值变化与ORP变化密切相关,硫酸盐的去除率与菌株的生长密切相关。

(3)菌株S-7对酸性废水中的Fe,Mn,Pb和Zn离子均具有一定的去除效果,整体上来看,菌株对4种离子去除效率为Pb＞Fe＞Zn＞Mn,其中Pb离子经7 d处理后去除率达100%。从目前处理结果来看,菌株S-7对4种离子的去除机制可能存在差异。

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《煤炭学报》第7次入选“百种中国杰出学术期刊”

2014年9月26日,科技部中国科学技术信息研究所在北京发布了最新的中国科技论文统计结果,《煤炭学报》在其所属的能源科学综合类期刊中各项评价指标优势明显,学科排名第一,再次荣获“百种中国杰出学术期刊”称号,这是《煤炭学报》第7次获此殊荣。

Isolation and identification of SRB and its utilization on processing of acid mine drainage of coal gangue dump

TANG Jie-lin1,HE Huan2,ZHANG Wen-juan1,HONG Fen-fen2,ZHANG Shu-ya1,SUN Meng1,TAO Xiu-xiang2
(1.School of Chemical Engineering and Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China;2.Key Laboratory of Coal Processing and Efficient Utilization,Ministry of Education,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221116,China)

In order to obtain the proper microbes to process the acid mine drainage from coal gangue dump,the sulfatereducing strain was isolated from surrounding soil of a coal gangue dump in Xiangtan City,Hunan Province,China．The 16S rRNA gene sequence,morphology,physiological and biochemical characteristics of isolated strain and its application on processing acid mine drainage were investigated．The 16S rRNA gene analysis shows that the strain S-7 has 99%phylogenic similarity with Desulfuromonas alkenivorans．The strain is slightly curved rods;the motile,with size (0．5-0．8)μm×(3．0-4．0)μm,appears as Gram-negative;and the optimum growth temperature and pH are 30℃and 6-8 respectively．The yeast powder is considered as the best carbon and nitrogen source,sodium sulfate as best sulfide source．After 96 h cultivation,the highest concentration of cells is up to 1．76×109per/mL．At initial pH=7 culture solution,the sulfate removal rate is up to 90%after 6 d cultivation．However,the different sulfate concentrations have no obvious effect on strain growth and sulfate removal rate．The S-7 strain has a better processing effect on Fe,Mn,Pb and Zn ions in the acid mine drainage of coal gangue dump,and the remove rate follows the order of Pb＞Fe＞Zn＞Mn．Among of them,the removal rate of Pb is up to 100%after 7 d processing．

TD849

A

0253-9993(2014)11-2307-08

2013-12-06 责任编辑:王婉洁

国家自然科学基金资助项目(51204184);江苏省自然科学基金资助项目(BK2012137);国家大学生创新基金资助项目(201310290035)

唐婕琳(1992—),女,湖南永州人,本科生。E-mail:tangjielin9@126．com。通讯作者:何 环(1981—),男,湖南平江人,副教授,硕士生导师。E-mail:hehuan6819@cumt．edu．cn

唐婕琳,何 环,张文娟,等．SRB菌的分离鉴定及其对矸石山酸性废水的处理[J]．煤炭学报,2014,39(11):2307-2314．

10．13225/j．cnki．jccs．2013．1803

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