细菌芽孢染色法的改良探索

郑冬超，王 甜，李媛媛，王雨昊，王 男，汪 红，曹 瑜

细菌芽孢染色法的改良探索

郑冬超，王 甜，李媛媛，王雨昊，王 男，汪 红，曹 瑜

（四川大学 生命科学学院，成都 610065）

文中对微生物学实验教材上介绍的Schaeffer－Fulton氏芽孢染色法进行了改进。用石碳酸复红试剂代替0.5番红水溶液作为复染剂，并对比不同石碳酸复红浓度及染色时间对染色效果的影响。结果表明，以石碳酸复红的10倍稀释液为复染剂，复染30 s～1 min时能达到最佳的染色效果。改进方法操作简单易行，染色效果对比鲜明，可使学生更易将菌体与芽孢区分开来。将改进的染色方法运用于微生物学实验教学，收到了良好的教学效果。

细菌；芽孢染色；石炭酸复红；番红

芽孢（spore）是指某些细菌（主要是芽孢杆菌属和梭菌属细菌）在一定的环境条件下，在菌体内部形成的圆形或卵圆形小体，是细菌的休眠方式，称为内芽孢（endospore），简称芽孢。能否形成芽孢，以及芽孢的形状、大小、位置、是否膨胀等形态特征，是鉴别细菌种类的重要依据［1］。芽孢具有厚而致密的壁，通透性小，不易被普通染料着色。所有芽孢染色法都首先选用着色力强的染料，并加热以促进样品着色；然后，使菌体脱色，保留芽孢上的染料；最后，使用不同颜色的复染剂进行复染，使菌体和芽孢呈不同的颜色［2］。芽孢染色是细菌分类的重要指标，是本科院校开设《微生物》课的学生必须熟练掌握的微生物染色技术，现有的微生物实验教材上介绍的染色方法是Schaeffer－Fulton氏染色法［3－7］。但该方法采用孔雀绿作为初染剂，0.5番红水溶液作为复染剂，染色后普遍存在芽孢、菌体着色度及对比度不明显，易褪色等缺点［8］。本研究以石碳酸复红溶液代替番红试剂作为复染剂，并寻找最佳的染色时间，从而推导出最佳染色效果的组合条件，目的是使学生能更快、更好地进行芽孢染色，清楚细致地区分菌体和芽孢的结构，提高实验教学质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）于牛肉膏蛋白胨培养基上37℃培养36～48 h的斜面培养物。

1.1.2 染色剂

石碳酸复红溶液的配制如下：

B液：石碳酸5.0 g，蒸馏水95 mL，将石碳酸溶解于水中，配成B液；将A液及B液混合即成。

1.1.3 仪器设备

酒精灯，载玻片，接种环，载玻片夹子，O-lympus显微影像分析系统（1 130万像素数码CCD、最高分辨率1 280×1 024）。

1.2 方法

分为制片—初染—脱色—复染—镜检五个步骤：即取适量培养好的枯草芽孢杆菌斜面菌种，常规涂片、干燥、固定，滴加5孔雀绿覆盖涂菌部位，加热至冒蒸汽并维持8 min，注意及时补充染液，切勿让涂片干涸。待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水呈现无色状态。用0.5番红或稀释5倍、10倍、15倍及20倍的复红溶液分别染色30 s、1 min、1.5 min、2 min。待载玻片晾干后，用油镜镜检并进行显微摄像。对比芽孢和菌体颜色深浅、对比度、背景清晰度等，客观评价染色效果，将染色结果分为优、良、中、差四个等级，以芽孢菌体对比度强、背景清晰为优。每种浓度及复染时间的组合实验均至少重复三次。

2 结果与分析

以芽孢和菌体颜色深浅、对比度、背景清晰度等为标准，对不同浓度复染剂及复染时间组合下的芽孢染色效果进行了客观评价，结果如表1所示。

图1 各种复染剂及复染时间组合下芽孢染色差异

表1 各种复染剂及复染时间组合下芽孢染色效果

3 结束语

目前，已有不少文献对初染过程进行改进，如将初染的加热方法改进为水浴蒸汽加热、烘箱加热［9］、滤纸覆盖加热［10］或微波炉加热［11－12］等，代替传统的酒精灯加热，从而简化操作步骤，减少了染色时间，并使得染色效果更为突出。但是，针对复染过程进行改进的研究报道较少。

［1］沈萍，陈向东.微生物学［M］.2版.北京：高等教育出版社，2006：53－59.

［2］朱陶，付灿.几种芽孢染色方法的比较与改进［J］.井冈山学院学报：综合版，2008，29（8）：149－150.

［3］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.3版.北京：高等教育出版社，2007：76.

［4］陈金春，陈国强.微生物学实验指导［M］.北京：清华大学出版社，2005：72.

［5］赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京：科学出版社，2002：42－43.

［6］杨革.微生物学实验教程［M］.北京：科学出版社，2004：22－23.

［7］唐丽杰.微生物学实验［M］.哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2005：41.

［8］杨健，何永林，刘晔华.微生物教学中常用细菌染色方法的改进［J］.川北医学院学报，2003，18（4）：165.

［9］叶生梅，高威.细菌芽孢染色方法改进研究［J］.微生物学杂志，2011，31（1）：106－109.

［10］胡洪杰，王玉，施鲁笛，等.抗酸染色和芽孢染色的改良型滤纸覆盖加热法［J］.中国病原生物学杂志，2009，4（1）：51－65.

［11］袁红，倪有娣，缪利英，等.介绍一种细菌芽孢微波染色法［J］.杭州医学高等专科学校学报，2002，23（5－6）：236.

［12］赵世鸿，夏世平，向丽，等.炭疽杆菌芽孢染色法的改进［J］.中国误诊学杂志，2004，4（9）：1429－1430.

A M odified Bacterial Spore Staining M ethod

ZHENG Dongchao，WANG Tian，LIYuanyuan，WANG Yuhao，WANG Nan，WANG Hong，CAO Yu
（School of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Schaeffer－Fulton's spore staining method introduced in the textbooks of experimental microbiology was optimized in our study.0.5safranine solution dyewas replaced by carbolfuchsin dye，and the staining effectswere explored in terms of carbolfuchsin concentrations and staining time.The results showed that the best staining results could be achieved with 1/10 carbolfuchsin dye，staining 30 seconds to 1 minute.The improved method was easy to operate，the staining effectwas obvious，and the structure ofmycelium and spore was easier to be distinguished.This method has been put into microbiological experiment teaching，and achieved better teaching results.

bacteria；spore staining；carbolfuchsin；sarranine

Q93－333

A

10.3969/j.issn.1672－4550.2014.05.008

2014－01－25；修改日期：2014－03－31

四川大学实验技术基金资助项目（2013－114）；国家微生物资源平台专项基金资助项目（NIMR－2014－8）。

郑冬超（1985－），女，博士，实验师，主要从事普通生物学实验教学工作。

曹 瑜（1984－），女，博士，主要从事微生物资源挖掘保藏等相关科研工作。