蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病小鼠脑组织形态学的影响

张朝颖，费洪新，张英博，贾博宇，韩玉生，杜 徽，白 云，朴成玉，周忠光

（1.哈尔滨医科大学 附属第四医院，哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是目前许多国家常见的老年性疾病，主要的机制是脑组织部位出现淀粉样物质的沉积，淀粉样物质的主要成分是β－淀粉样蛋白（Amyloid beda，Aβ）［1］。Aβ 的沉积会引起机体氧化反应，脑组织形态学的改变，主要引起的是与机体学习记忆密切相关的部位，例如海马部位、颞叶皮质区域的改变［2，3］。蝙蝠葛碱（Dauricine，DAU）具有广泛的生物学作用，如抗氧化作用［4］、脑缺血保护作用［5，6］等。基于此本试验采用APP/PS1双转基因AD小鼠模型，研究DAU对AD小鼠脑组织的保护作用。

1 试验材料

1.1 试验动物

3月龄雄性、APP/PS1双转基因小鼠（B6.Cg－Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax）、体重23 ±2g，由哈尔滨医科大学解剖教研室吴树亮教授赠送，并进行基因鉴定。动物常温、常湿饲养，自由摄取食物。另外做对照的小鼠是同月龄、同背景小鼠，由黑龙江中医药大学药物安全评价中心李宝龙副教授购买提供。

1.2 主要药物

吡拉西坦购于湖南迪诺制药有限公司，批号130325;DAU购于 MUST公司，批号 MUST—13010313，纯度为98.66%;其他试剂均为国产分析纯。

2 试验方法

2.1 动物一般状态观察

该品种小鼠一般状态观察包括进食、饮水、体重、毛发、色泽、活动度、光泽度、粪便颜色、垫料潮湿度等指标。

2.2 动物分组

选择AD小鼠18只，分3组，其中模型组6只、治疗组6只、DAU组6只，另设立同月龄、同背景的C57小鼠对照组6只。

2.3 动物给药

每天上午选择对照组小鼠6只给予生理盐水灌胃。模型组6只给予生理盐水灌胃。治疗组6只给予吡拉西坦（0.62 g·kg－1·d－1）灌胃。DAU 组 6 只给予 DAU（20 mg·kg－1·d－1）灌胃，持续2W。

2.4 多聚甲醛固定

小鼠乙醚麻醉、剪开腹腔、胸腔、右心耳，针头插入左心室，缓慢匀速对小鼠灌注生理盐水，肝变白后缓慢匀速灌注4%多聚甲醛50 mL，断头取脑组织固定。

2.5 制备石蜡切片

小鼠灌注固定后流水冲洗、脱水、透明、包埋、－20℃冰箱冷冻组织、切片5μm、做成石蜡切片。

2.6 动物脑组织HE染色

石蜡切片脱蜡、脱水、水洗、苏木精染10 min、冲洗、盐酸乙醇分化数秒、水洗、氨水处理、水洗、伊红染色、水洗、脱水、透明、干燥、树胶封片、显微镜观察脑组织颞叶皮质和海马的结构。

2.7 统计学分析结果

3 结果

3.1 动物一般状态观察

对照组小鼠活动自如，逃避反应灵敏，皮肤光滑，无瘀斑，毛色光亮，饮食饮水正常。模型组小鼠活动能力下降，怕冷，受到刺激躲避反应较差，不活跃，皮肤松弛。治疗组小鼠，皮肤较光滑，活跃，较模型组改善明显。DAU组小鼠状态比较活跃，饮食饮水正常，反应较灵敏。

3.2 动物脑组织HE染色

3.2.1 颞叶皮质区域HE染色

脑组织对照组颞叶皮质神经元形态正常，细胞核清晰可见，细胞质丰富（见图1A）。模型组颞叶皮质神经元较小，细胞核较小，细胞质不丰富（见图1B）。治疗组神经元比较正常，排列较规则（见图1C）。DAU组神经元变性的数目较少，神经元基本正常（见图1D）。

图1 小鼠脑组织颞叶皮质HE染色（高倍镜10×40）Fig.1 M ouse cerebral tem poral lobe cortex HE staining（High magnification 10×40）

3.2.2 海马区域HE染色

脑组织对照组锥体细胞层数较多，神经元锥体形，细胞排列紧密，细胞核和细胞质清晰可见（见图2A）。模型组锥体细胞层数减少，细胞变性明显，可见到细胞核固缩（见图2B）。治疗组和DAU组细胞形态和排列方式均得到明显的改善（见图2C、2D）。

图2 小鼠脑组织海马HE染色（高倍镜10×40）Fig.2 M ouse hippocampal brain tissue HE staining（High magnification 10×40）

4 讨论

生物体衰老的过程是极其复杂的变化过程，其中自由基的反应在其中起到很重要的作用，自由基的大量产生使机体产生氧化的物质，这些物质会引起脑组织的损伤，脑组织损伤后神经元的结构就会发生改变［2］。DAU具有抗氧化的作用，因此本试验主要研究DAU对脑组织因抗氧化引起的的形态学变化，观察脑组织颞叶皮质和海马的神经元形态结构。

针对AD模型很多，包括 D－半乳糖加亚硝酸钠［7］、APP/PS1双转基因［8］等模型对机体的痴呆进行研究。本试验采用APP、PS1两个基因同时转入C57小鼠的痴呆模型进行研究，观察DAU对APP/PS1双转基因的形态学影响。试验中观察了各组小鼠的生长状态，显示该品种小鼠对饲养条件要求很高，需要清洁的饮用水，饲料和垫料专门购买，即使如此，该小鼠生长也非常缓慢。

试验中对小鼠进行了心脏灌注、石蜡切片、常规的HE染色，染色结果显示小鼠脑组织的结构变化。颞叶皮质区域经过HE染色显示脑组织对照组颞叶皮质神经元形态正常，细胞核清晰可见，细胞质丰富。模型组颞叶皮质神经元较小，细胞核较小，细胞质不丰富。治疗组神经元比较正常，排列较规则。DAU组神经元变性的数目较少，神经元基本正常。

试验对海马区域HE染色显示脑海马组织对照组锥体细胞层数较多，神经元锥体形，细胞排列紧密，细胞核和细胞质清晰可见。模型组锥体细胞层数减少，细胞变性明显，可见到细胞核固缩。治疗组和DAU组细胞形态和排列方式均得到明显的改善。综上所述，DAU可以维持AD小鼠脑组织神经元正常的形态结构，减轻AD的临床症状，从而保护AD小鼠的脑组织结构。

［1］WU Y L，XIN X J，XIN X L，et al.Research progress about the regulation of GXXXG structures in the Alzheimer-related protein［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（1）:1—4.

［2］ROSSIL，MAZZITELLIS，ARCIELLOM，etal.Benefits from dietary polyphenols for brain aging and Alzheimer’s disease［J］.Neurochem Res，2008，33（12）:2390—2400.

［3］PEREIRA AG，PORTUGUEZ MW，DACOSTA DI，et al.Route learning performance:is ita hippocampus function?［J］.Cognitive and Behavionral Neurology，2011，24（1）:4—10.

［4］何丽娅，李立中，吴基良.蝙蝠葛碱的抗氧化实验研究［J］.中草药，1997，28（8）:479—481.

［5］李艳红，黄向江，卢浩浩.蝙蝠葛碱对大鼠局灶性脑缺血及线粒体氧化损伤的保护作用［J］.华中科技大学学报（医学版），2005，34（3）:270—273.

［6］李艳红，龚培力.蝙蝠葛碱对实验小鼠脑缺血的保护作用［J］.中国药理学通报，2004，20（5）:564—567.

［7］何胜，玉莹，陈菊芳，等.D－半乳糖加亚硝酸钠建立痴呆症小鼠模型和中药治疗的效果［J］.中国老年学杂志，2014，34（2）:422—424.

［8］周妍妍，刘艳丽，董春雪，等.五味子醇甲对APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠脑组织突触素、α－突触核蛋白表达的影响［J］.中国药理学通报，2013，29（8）:1076—1079.