超高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中药物残留量

陈 娟 罗 艳 吴春燕 马 岩 杨俊华

（1.宁夏兽药饲料监察所，宁夏银川 750011；2.宁夏农垦农林牧技术推广服务中心，宁夏银川 750011）

氯霉素类药物是一种广谱抑菌性抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有作用，临床是治疗伤寒杆菌、副伤寒杆菌、沙门氏菌感染的首选药。代表性药物主要有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。由于氯霉素会抑制骨髓造血功能，造成再生障碍性贫血，所以，很多国家都已经禁止在食用性动物上使用氯霉素。甲砜霉素不产生再生障碍性贫血，但抑制红细胞、白细胞、血小板的生成。欧盟、美国禁用于食品动物。氟苯尼考抗菌活性优于氯霉素、甲砜霉素，对氯霉素耐药的菌株仍敏感不引起骨髓抑制或再生障碍性贫血，但有胚胎有毒性，妊娠动物禁用，在鸡肉中的残留限量为100 μg/kg。本研究拟采用LC-MS/MS方法建立鸡肌肉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考3种药物的多残留检测方法，以期为该类药物的残留监控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ超高效液相色谱-串联质谱联用仪，Waters公司；AE-205电子天平，Mettler Toledo公司；CT15RT高速冷冻离心机，日立公司；Organomation Associates 氮吹仪，Jnc公司；MS1旋涡合器，IKA公司；LR4000旋转蒸发器，Heidolph公司。

1.2 试剂与材料

对照品：氯霉素、氘代氯霉素内标物，纯度大于95%，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；甲砜霉素、氟苯尼考，纯度大于95%，中国兽医药品监察所；甲醇为Fisher公司；乙酸乙酯为色谱纯；正己烷为色谱纯；水为超纯水；氨水为分析纯。

1.3 标准储备液和工作液的配制

精密称取氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考对照品各10 mg，分别置100 ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释成100 μg/ml的标准储备液；分别准确吸取三种标准储备液适量，置于10 ml容量瓶中，用甲醇稀释成适宜浓度的中间混合标准工作液。准确吸取适量氘代氯霉素内标物储备液，用甲醇稀释成适宜浓度的中间浓度内标溶液。

1.4 标准曲线绘制

准确吸取适量中间混合标准工作液和中间浓度内标溶液，用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液，氯霉素系列浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L，甲砜霉素和氟苯尼考系列浓度为2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 μg/L，内标物浓度为5 μg/L。从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.5 UPLC-MS/MS分析条件 色谱条件

色谱柱为Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为甲醇，B为水，梯度洗脱：0～6 min，10%A线性变化至90%A；6～7 min，90%A线性变化至10%A，保持1.9 min。流速0.3 ml/min，柱温为30 ℃，进样量10 μl。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI-），毛细管电压2.8 KV，源温150 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，雾化气流速1 000 L/h，锥孔气流速50 L/h。多反应监测各离子对及对应锥孔电压、碰撞能量见表1。

表1 3种药物的定性、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量

1.6 样品前处理

准确称取均质后的试料（2+0.05）g，置于50 ml离心管内，加入20 ng/ml D5-氯霉素标准工作液250 μl，加入乙酸乙酯15 ml，再加入0.45 ml氨水，5 g无水硫酸钠，旋涡混匀，超声提取5 min，5 000 r/min离心5 min，取上清液于鸡心瓶中，重复提取一次，合并提取液于鸡心瓶看，45℃旋转蒸干。残留物用1 ml水溶解，再加入3 ml正己烷旋涡混合30 s，静置分层。弃去上层正己烷，再加入3 ml正己烷旋涡混合30 s，静置分层，移取下层水相于1.5 ml离心管中，以13 000 r/min离心5 min，过0.2 μm滤膜后，供超高效液相色谱-串联质谱仪分析。

2 结果

2.1 方法线性

准确量取适量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和内标物标准储备液，制得浓度为0.5、1、2、5、10 μg/L氯霉素基质校准标准系列工作液（内标浓度为5 μg/L）、甲砜霉素及氟苯尼考基质校准标准系列工作液2、4、8、20、40 μg/L（内标浓度为5 μg/L），依次上机测定，以各药物定量离子质量色谱峰面积与对应的内标峰面积比值为纵坐标（y），标准浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到线性方程（表2）。三种药物在系列浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.99。

图1 甲砜霉素标准曲线

图2 氟苯尼考标准曲线

图3 氯霉素素标准曲线

表2 3种药物标准曲线及相关系数

2.2 方法精密度与准确度

在空白鸡肌肉中添加氯霉素0.25 ug/kg、0.5 ug/kg、1 ug/kg及甲砜霉素、氟苯尼考1 ug/kg、2 ug/kg、4 ug/kg 3个不同浓度进行回收率试验，结果汇总见表3。可以看出，氯霉素的平均回收率为94.0%～96.9%，批内批间相对标准偏差均小于10%；甲砜霉素平均回收率为87.4%～98.2%，批内批间相对标准偏差均小于10%；氟苯尼霉平均回收率为99.5%～103%，批内批间相对标准偏差均小于10%。

图5 0.25ng/g（1ng/g）空白鸡肌肉添加3种药物的特征离子质量色谱图

表3 空白鸡肌肉中添加3种药物的回收率和精密度实验结果

3 结论

本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定鸡肉中3种氯霉素类药物，方法线性、回收率和精密度等得到参数均能满足兽药残留分析方面的要求。

[1]孙雷，张骊，王树槐，等.超高效液相色谱法—串联质谱法检测动物源食品中氯霉素类药物及其代谢物残留[J].中国兽药杂志.北京：2009，43（3）：42-45.

[2]陈小霞，岳振峰，吉彩霞.高效液相色谱-电喷雾电离三级四级杆质谱测定鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量[J].色谱，2005，（1）：92-95.

[3]中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》[S].2002.