银杏叶提取物的长期毒性研究

季 迁李 哲李 敏刘 芳姜殿军

（1 沈阳医学院，辽宁 沈阳 100034；2 沈阳医学院奉天医院神经内科，辽宁 沈阳 110034）

银杏叶提取物的长期毒性研究

季 迁1李 哲2李 敏1刘 芳2姜殿军1

（1 沈阳医学院，辽宁 沈阳 100034；2 沈阳医学院奉天医院神经内科，辽宁 沈阳 110034）

目的 选用高于临床拟用剂量30倍和120倍的剂量组进行“限度实验”观察其长期毒性作用。方法 将90只Wister大鼠随机分3组，即生理盐水对照组，银杏叶提取物低、高剂量组，灌胃给药24周后检测血液学和血液生化指标，同时解剖并摘取各组织脏器，计算脏器系数，进行病理学检查分析。结果 与对照组比较，银杏叶提取物高、低剂量组大鼠的脏器系数未发生显著性变化（P＞0.05），但多项血液学指标和血液生化指标发生显著改变。结论 用渗漉法制备的银杏叶提取物对大鼠有降血脂、抗血栓作用，长期大剂量使用可显著改变多项血液学和血液生化指标，还可能引起消化性溃疡与肿瘤。

银杏叶提取物；长期毒性

随着对银杏叶的化学成分和药理作用的深入研究，证实银杏叶提取物对多种疾病有确切的治疗作用，尤其在防治心脑血管疾病方面被广泛开发应用。

本实验用渗漉法制备银杏叶提取物，并选用高于临床拟用剂量30倍和120倍银杏叶提取物的低、高剂量组长期给药，进行“限度实验”，观察银杏叶提取物是否具有毒副作用。通过系统的毒理学研究，为确定其最大安全剂量，指导临床用药和制药企业控制银杏叶产品质量提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

主要药品和试剂：银杏叶、蒸馏水、生理盐水、无水乙醇、丙酮、甲醛、乌拉坦。

主要器材及物品：渗漉器（沈阳医学院药理教研室提供）；全自动血液分析仪（美国BECKMAN COULTER Gen.S）；全自动生化分析仪（日本日立公司）；冰冻病理切片机（德国SLEE公司）；显微镜（美国VSI公司）；SPSS 10.0统计分析软件等。

动物：Wister大鼠90只（体质量60～70 g），雌雄各半，由沈阳医学院动物实验中心提供（动物合格证：SCSK，辽2003-0016）。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏叶提取物的制备

按正规流程操作，制备银杏叶渗漉液，再旋转蒸发回收得浸膏，用丙酮溶解，冰水浴下超声波分散，室温静置24 h，过滤后挥发丙酮，即得银杏叶粗提物。

1.2.2 银杏叶提取物的长期毒性试验

1.2.2.1 实验分组：将90只Wister大鼠随机分为3组，每组雌雄各半。即生理盐水对照组、低剂量组和高剂量组。

1.2.2.2 给药方式：每天早晚各1次灌胃给药，共24周。低剂量组：按1.03 g/（kg·d）剂量，相当于人临床日剂量的30倍。高剂量组：按4.12 g/（kg·d）剂量，相当于人临床日剂量的120倍。生理盐水对照组：将生理盐水按照20 mL/（kg·d）剂量。

1.2.2.3 观察指标

①综合指标观察：包括动物外观体征、行为活动和粪便性状等。每天给药前称重，再定量给药，并计算平均食物摄入率。实验过程中若有动物死亡及时解剖，观察、推测死亡原因。在末次给药后，禁食15 h，不禁水，称重。②血液学和血液生化指标观察：乌拉坦麻醉，腹腔主动脉采血，每只动物采3 mL全血不加抗凝剂，2 mL全血加0.15 g枸橼酸钠抗凝，供检测。③采血后解剖实验大鼠，摘取主要脏器称重，计算脏器系数（脏器系数=脏器重量/体质量）。并做病理切片，进行病理学检查分析。

1.2.3 数据处理

用SPSS10.0统计软件分析处理。

2 结 果

2.1 对动物一般体征影响

给药过程中，高、低剂量组动物毛色光泽逐渐消失，食物摄入量显著减少。其中高剂量组部分动物腹部胀大，触有肿块。给药2个月后，高、低剂量组动物体质量明显减轻，高剂量组动物出现死亡。经解剖观察，推测动物死于消化系统溃疡穿孔。

2.2 脏器系数的改变

给药24周后，将动物麻醉，解剖并取出主要脏器，测定脏器系数结果见表1。与生理盐水对照组相比较，P＞0.05。

2.3 血液学指标的改变

服用银杏叶24周后，高、低剂量组大鼠的血液学指标有多项发生显著的改变。其中，中性粒细胞百分比，单核细胞百分比、嗜酸细胞百分比、嗜碱细胞百分比、红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞容积和血小板计数显著降低（P＜0.01），而淋巴细胞百分比和血小板平均体积则显著增加（P＜0.01），见表2。

2.4 血液生化指标的改变

服用银杏叶24周后，高、低剂量组大鼠的血液生化指标有多项发生显著的改变。其中，尿素、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白和肌酸磷酸激酶水平显著下降（P＜0.01）；凝血酶原时间显著延长（P＜0.01）；血钾降低，血钠升高（P＜0.01），但血氯水平改变不显著（P＞0.05）。见表3。

表1 不同剂量银杏叶对大鼠脏器系数的影响[()，mg/g]

表1 不同剂量银杏叶对大鼠脏器系数的影响[()，mg/g]

注：与对照组相比较*P＞0.05

组别 心 肝 脾 肺 肾 肾上腺 胸腺 子宫 睾丸 脑对照组 5.3±0.3 43.7±6.6 3.5±1.2 10.8±2.0 7.7±1.3 0.3±0.1 1.3±0.6 1.9±0.6 11.0±1.2 8.3±0.8低剂量组 5.0±1.1* 42.9±10.3* 4.4±2.8* 10.0±8.7* 7.5±5.0* 0.3±0.1* 1.3±0.3* 2.0±0.5* 10.5±1.3* 8.1±1.8*高剂量组 4.6±0.8* 41.6±5.4* 3.9±2.1* 10.2±1.0* 6.6±0.6* 0.4±0.1* 0.9±0.4* 1.2±0.9* 11.1±1.9* 7.8±1.3*

表2 不同剂量银杏叶对大鼠血液学指标的影响（）

表2 不同剂量银杏叶对大鼠血液学指标的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.01；●P＜0.01

血液学指标 对照组 低剂量组 高剂量组白细胞计数(109/L) 14.83±80.08 13.68±15.32 15.01±8.76中性粒细胞百分比(%) 21.63±7.19 20.92±14.29* 11.26±4.97*淋巴细胞百分比(%) 62.93±12.74 66.20±2.33● 78.66±7.32●单核细胞百分比(%) 10.59±3.89 8.54±3.90* 6.28±2.54*嗜酸细胞百分比(%) 1.88±0.95 1.82±0.89* 1.18±1.07*时间细胞百分比(%) 0.94±0.55 0.87±0.60* 0.62±0.13*红细胞计数(1012/L) 6.58±1.68 5.16±1.59* 4.52±1.50*血红蛋白含量(g/L) 105.44±19.82 104.56±20.62* 71.40±22.12*红细胞比容(%) 0.32±0.07 0.33±0.07* 0.22±0.07*平均红细胞体积(fL) 49.50±3.84 49.31±3.70 49.40±2.10平均红细胞血红蛋白含量(pg) 16.36±2.32 15.88±1.94 15.94±0.74平均红细胞血红蛋白浓度(g/L) 329.33±26.77 321.33±21.70 322.60±15.98红细胞分布宽度(%) 14.26±1.39 ±14.53±1.68 14.12±1.30血小板计数(109/L) 559.8±142.10 529.44±191.14* 431.80±146.69*血小板平均体积(fL) 5.95±0.19 6.02±0.23● 6.58±0.82●网织红细胞计数(109/L) 4.34±1.89 5.11±2.19 5.09±2.23

2.5 大鼠脏器的病理学改变

图1 大鼠肠黏膜上疑似淋巴瘤

表3 不同剂量银杏叶对大鼠血液生化指标的影响（）

表3 不同剂量银杏叶对大鼠血液生化指标的影响（）

注：与对照组比较*P＜ 0.01；●P＜ 0.01；○P＞0.05

血液生化学指标 对照组 低剂量组 高剂量组尿素(mmol/L) 11.59±1.19 7.36±1.31* 6.86±1.22*肌酐(μmol/L) 37.08±2.57 28.40±8.64* 25.13±4.45*三酰甘油(mmol/L) 0.92±0.07 0.67±0.15* 0.57±0.18*总胆固醇(mmol/L) 1.99±0.16 1.29±0.21* 1.32±0.34*

服用银杏叶24周，高剂量组大鼠中有85 %出现肉眼可见的胃或十二指肠溃疡，有50 %腹腔中肠黏膜上出现肿瘤，有的长径可达6 cm，肿瘤及其病理切片如图1、2所示。肿瘤组织细胞呈卵圆形，有典型的滤泡中心细胞样肿瘤细胞，为肠黏膜淋巴瘤。

图2 淋巴瘤病理切片（HE染色，×400）

3 讨 论

银杏叶为银杏科植物银杏的干燥叶，银杏叶提取物中富含天然的药理活性成分黄酮苷和银杏内酯，大量实验和临床研究表明这些活性成分具有明显的抑制血小板聚集作用[1]。

目前，有关银杏叶制剂的毒性研究报道很多，基本结论是安全可靠，外观体征、行为活动、体质量增长均无异常变化；血液学和血液生化学检查均在正常范围；组织病理学检查未见明显异常。但有关研究所采用的剂量较小，大鼠的平均治疗剂量为34 mg/kg，也许不能完全反映出药品的毒性。本实验选用两个高于临床拟用剂量30倍和120倍的剂量组，进行限度实验。结果表明，大鼠服用银杏叶提取物24周后，高、低剂量组的血液学和血液生化学指标有多项发生非常显著的改变。其中，中性粒细胞百分比，单核细胞百分比、嗜酸细胞百分比、嗜碱细胞百分比、红细胞计数、血红蛋白含量、红细胞容积和血小板计数显著降低（P＜0.01），而淋巴细胞百分比和血小板平均体积则显著增加（P＜0.01）；尿素、肌酐、三酰甘油、总胆固醇、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白肌和酸磷酸激酶水平显著下降（P＜0.01）；凝血酶原时间显著延长（P＜0.01）；血钾降低，血钠升高（P＜0.01），但血氯水平改变不显著（P＞0.05）。

各脏器系数与正常对照组比较P＞0.05，无显著差异，表明各主要脏器未发生显著萎缩或退行性改变。但高剂量组大鼠中产生了消化性溃疡和肿瘤，病理组织学检查结果显示，肿瘤组织细胞呈卵圆形，有典型的滤泡中心细胞样肿瘤细胞，疑为肠黏膜淋巴瘤。银杏叶提取物中含有银杏酸，它是国内外公认的潜在致敏物质，可引起消化道黏膜过敏反应，降低黏膜屏障作用，导致消化性溃疡。但存在于银杏叶提取物中致使肿瘤形成的具体毒性成分，尚待研究。余启枝等[2]证实对犬每日按80 mg/kg静脉滴注3个月，肾脏部分肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡变性。

本实验结果表明，大鼠长期大剂量使用银杏叶提取物，能降血脂、抗血栓形成，但有可能引起消化性溃疡与肿瘤，同时可使多项血液学和血液生化指标发生显著改变。

[1] Zhinden S,Seiler CH.Phytotherapy in cardiovascular medicine[J]. Ther Umsch,2002,59(6):301-306.

[2] 余启枝,王政荣,张同辉,等.注射用银杏内酯B毒性试验研究[J].中国药师,2011,14(11):1629-1632.

R282.71；R-33

：B

：1671-8194（2014）04-0055-02