痔疮胶囊微生物限度检查法验证研究

笪宁虞

摘要：建立痔疮胶囊微生物限度检查法。关键词：痔疮胶囊；微生物限度检查；方法验证【中图分类号】R965【文献标识码】B【文章编号】1672-8602(2014)04-0120-01痔疮胶囊具有清热解毒，凉血止痛，祛风消肿的功效。用于痔疮，肛裂，大便秘结等症。含有大黄等中药成分。根据其制剂用药途径和制法，应进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经实验研究，确定采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌检查。经对所确定的方法进行验证，符合《中国药典》2010年版一部附录XIIIC有关微生物限度检查法有关规定，方法可行。1实验仪器、试药 1.1实验菌种:枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉。1.2样品：痔疮胶囊（批号：120301、120402、120603）；生产：广西锦莹药业有限公司。1.3培养基及稀释剂:营养琼脂培养基，BL培养基等。1.4仪器:培养箱、生物安全柜等。2细菌数、霉菌和酵母菌数检验方法的建立及验证 2.1菌液制备:取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用；取经25℃培养24～48h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液,备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加10 ml 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%无菌氯化钠溶液制备成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。2.2供试液的制备方法: 常规法：取样品10g，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液；取1：10的供试液1ml注皿。2.3回收率试验:试验组：同2.2，另分别取各试验菌50～100CFU，分别注入同一平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h。菌液组：取试验菌50～100CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h，测定所加入的试验菌数，平行制备2个平皿。供试品对照组：同2.2，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度，细菌培养24～48h，霉菌和酵母菌培养48～72h，测定供试品本底菌数。2.4方法的确定:选用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌作为敏感菌株进行预试验，结果见表1：表1敏感菌株常规法预试验结果 菌种 金黄色葡萄球菌（CFU/平皿） 白色念珠菌（CFU/平皿）计数 平皿 平均值平皿 平均值试验组 95 96 96 89 85 87供试品对照组 0 0 0 0 0 0菌液组 101 95 95 97 92 87 95 91回收率（%） 99 96结果：金黄色葡萄球菌回收率为99%，大于70%；白色念珠菌回收率为96%，大于70%，表明痔疮胶囊对细菌、真菌无抑制作用，采用常规法进行细菌数、霉菌和酵母菌数测定可行。2.5细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证取3个批号痔疮胶囊样品，细菌数、霉菌及酵母菌数按常规法进行加菌回收率试验，结果见表2、3、4：表2批号为120301的痔疮胶囊回收率试验结果菌种回收率大肠埃希菌枯草芽孢杆菌 金黄的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉计数平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值试验组118 125 121 98 87 92 111 125 118 149 179 164 119 123 121供试品对照组0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）110 111 83 149 89表3批号为120402的痔疮胶囊回收率试验结果 菌种回收率大肠埃希菌枯草芽孢杆菌 金黄的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉计数平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值试验组96 133 114 80 102 91 129 136 132 145 152 148 125 108 116供试品对照组0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）104 110 92 135 85表4批号为120603的痔疮胶囊回收率试验结果 菌种回收率大肠埃希菌枯草芽孢杆菌 金黄的葡萄球菌 白色念珠菌 黑曲霉计数平皿 平均值平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值 平皿 平均值试验组103 112 107 92 80 86 125 123 124 158 144 151 109 126 117供试品对照组0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0回收率（%）97 104 87 137 86三个批号样品的验证试验结果表明，以常规法进行痔疮胶囊细菌数、霉菌及酵母菌数测定，五种规定试验菌的回收率均大于70%，符合《中国药典》2010年版的规定，方法可行。3控制菌检验方法的建立及验证 菌液制备同2.1。3.1大肠埃希菌： 常规法：试验组：取1：10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基，同时加入大肠埃希菌10～100CFU，35℃培养24～48h。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管中，35℃培养24h左右，366nm紫外灯下观察荧光，然后进行靛基质试验，观察结果；另取培养物划线接种于曙红亚甲蓝（EMB）平板，35℃培养18～24h，观察其菌落形态。阴性菌对照组：取金黄色葡萄球菌作为阴性对照试验菌，方法同试验组。3.2试验结果： 大肠埃希菌：常规法试验结果：试验组与陰性对照组相比较有明显的变化，实验组有明显产酸产气现象，结果如表5: 表5大肠埃希菌检查常规法试验结果大肠埃希菌 试验组 阴性菌对照组BL + -MUG，靛基质 +，+ -，-EMB平板 + -4结语 根据上述实验结果，拟定痔疮胶囊微生物限度检查法标准正文如下：微生物限度取本品10g，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成1：10的供试液。细菌数、霉菌和酵母菌数、大肠埃希菌：取1：10的供试液，采用常规法，依法检查，应符合规定。细菌数每1g不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得过100cfu，大肠埃希菌每1g不得检出。5三批痔疮胶囊的微生物限度检查 按上述所建立的痔疮胶囊微生物限度检查法，对三批样品进行检验，结果见表6表6三批痔疮胶囊微生物限度检查结果批号 细菌数 霉菌、酵母菌数 大肠埃希菌 结论120301 小于10个/g 小于10个/g 未检出 符合规定120402 小于10个/g 小于10个/g 未检出 符合规定120603 小于10个/g 小于10个/g 未检出 符合规定参考文献[1]2010年版《中国药典》一部(上接第119页)3讨论 舒张性心力衰竭主要与心室充盈功能障碍等有关，由于左心室射血过程中承受压力最大，造成心室充盈损伤更严重，加上患者伴有高血压疾病，长期高血压控制不力，导致患者交感神经异常兴奋，肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能紊乱，水钠代谢异常，加重肺淤血症状[5]。相关研究表明舒张性心力衰竭与高血压及年龄密切相关，对于老年高血压伴发舒张性心力衰竭患者来说，高血压进一步加重舒张功能损伤及心室充盈损伤，且血压不间断上升加重心脏负荷，可能演变为充血性心力衰竭，最终威胁患者性命。相关研究及临床实践表明螺内酯治疗老年高血压伴舒张性心力衰竭效果明显，这与螺内酯内在机制有关，该药物属于一种特异性醛固酮拮抗剂，不仅可以利尿、保钾及镁元素，而且还可以增强心脏摄取去甲肾上腺素能力，维持心率平稳，缓解患者心肌纤维变性及心律失常等症状，在心力衰竭、高血压患者中得到广泛的应用。6分钟步行测验作为临床上一种操作简单的测定方法，主要是评价老年心力衰竭患者心脏功能及运动耐受力，本研究中实验组患者经螺内酯治疗后6分钟步行距离明显长与对照组，t值为4.755，差异有统计学意义，P＜0.05。可见螺内酯可以更有效的改善患者心功能，提高患者运动耐受力。同时治疗中用超声心动图检查患者左心室功能，由于心动图可以全面、连续、多方位的对患者心脏监测，且能深入剖析心脏构造，为此监测结果更准确，为患者早期治疗提供重要依据。实验组患者治疗后超声心动图观测到E峰值、A峰值、E/A值明显优于对照组，可见螺内酯可明显改善患者心室舒张功能。另外，治疗过程中对所有患者的血浆脑钠肽及胶原氨基端肽等指标进行测定，这是因为血浆脑钠肽源自心室肌细胞，能有效扩张血管，抑制交感神经系统兴奋，效果与螺内酯类似，可将其作为心力衰竭严重程度的判断标志。而胶原氨基端肽可以有效反映心肌纤维化程度。本研究中实验组患者治疗后血浆脑钠肽及胶原氨基端肽下降明显优于对照组，P＜0.05。综上所述，螺内酯能明显改善高血压合并舒张性心力衰竭老年患者心功能，提高其运动耐力，可深入研究利用。参考文献[1]刘德惠.螺内酯治疗老年高血压并发舒张性心力衰竭疗效分析[J].中国药物经济学,2013（06）:54-56. [2]朱志辉,孙维龙.螺内酯治疗老年高血压并发舒张性心力衰竭的疗效分析[J].北方药学,2013（09）:20-21. [3]刘海军,籍振国.螺内酯对老年高血压并发舒张性心力衰竭的疗效观察[J].疑难病杂志,2010（09）:674-675. [4]Borlaug BA，Lam CS，Roger VL，et al. Contractility and ventricular systolic stiffening in hypertensive heart disease insights into the pathogenesis of heart failure with preserved ejectionfraction [J]. J Am Coll Cardiol，2009（5）：410-418.[5]BadleM,RolgE,peerz-Villa F，et al.Incerased expression of the renin-angiotensin system and mast cell density but not of angiotensin-converting enzyme II in late satges of human heart failure [J].2006 (9):1117-1125.