探讨宫颈癌的放射生物学机理

雒永岐

【摘要】 目的 探讨放射前、后人宫颈癌组织增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化。方法 在多聚甲醛固定的活检癌组织冰冻切片上，进行PCNA的免疫组织化学染色。结果 放疗前的宫颈癌组织内，多数癌细胞呈PCNA免疫染色阳性；照射（30-40Gy）后，多数癌细胞无PCNA染色，但间质细胞的PCNA免疫染色明显升高，大量间质细胞则呈中等或强阳性染色。结论 放射抑制宫颈癌细胞的PCNA表达的同时，诱导间质细胞的PCNA表达。提示PCNA的表达状态可作为放射治疗中评价宫颈癌细胞增殖和间质组织修复的分子指标之一。

【关键词】 增殖细胞核抗原；宫颈癌；放射疗法

文章编号：1004-7484（2014）-06-3102-01

近年来宫颈癌已经成为女性患者中较常见的恶性肿瘤疾病，宫颈癌的放射治疗方法具有非常好的疗效，放疗以后的远期生存率也比较高。可见，宫颈癌放射生物学机理的研究，对肿瘤的整体放射水平具有十分深远的意义。增殖细胞核抗原（PCNA）是一种高度保守的蛋白分子，具有参与DNA复制和DNA修复的功能，PCNA的表达情况是反映细胞增殖状态的重要指标，研究资料表明PCNA在宫颈癌组织中有表达，但PCNA在宫颈癌放射治疗中的意义，有待于进一步阐明。因此我们利用免疫组织化学等方法，对放射治疗中宫颈癌组织PCNA的变化及其意义进行了探讨。

1 资料和方法

1.1 临床资料与活检材料 宫颈癌活检组织标本20例，取自临床病理诊断为鳞状细胞癌患者，病理分级为Ⅰ-Ⅱ。患者年龄为34-58岁。其中，放疗前标本9例，放疗后标本11例。接受放射治疗的患者分别接受盆腔照射30-40Gy/15-20次.宫颈癌活检组织标本，入40g·L-1多聚甲醛0.1mol·L-1的磷酸缓冲液（pH7.4），4℃下固定24-48h.然后换入30g·L-1蔗糖溶液内，4℃下过夜.冰冻连续冠状切片，切片厚10μm，每例取30张切片，按顺序分为3套，置于-20℃保存备用.染色前将切片晾干，然后分别作常规HE染色、PCNA免疫组化染色和对照染色。

1.2 免疫组织化学染色（ABC法） 切片于10mmol·L-1磷酸缓冲盐水（PBS，pH7.4）内洗10min，再入含0.3ml·L-1过氧化氢溶液内处理30min，用以灭活内源性过氧化物酶.经PBS洗后，入鼠抗PCNA单克隆抗体（浓缩型第一抗体，从博士德公司购买，用含2ml·L-1正常山羊血清和0.1ml·L-1TritonX-100的PBS稀释，1∶100）内，于4℃下孵育48h.然后入biotin标记的兔抗鼠IgG（1∶200，Vector公司）溶液内，室温下放置4h.入ABC复合物（1∶200，Vector公司产品）溶液，室溫下孵育2h.每次抗体孵育后均用PBS洗，3×10min.最后入DAB/H2O2溶液（0.05g·L-1/0.01g·L-1）反应10min.另外，用正常小鼠血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照。

1.3 半定量分析 参照以往文献中的定量方法，对PCNA免疫染色阳性细胞的半定量分析，在放疗前（n=8）和放疗后（n=10）活检组织10μm切片（10张/例）上，随机选取一高倍视野，计数单位面积（6.25mm2）PCNA免疫阳性细胞数目。

1.4 统计学检验 比较放疗前与放疗后两组的PC-NA免疫阳性胞体细胞数目（χ±s），进行单因素χ2检验。

2 结 果

2.1 宫颈癌组织的病理学观察 在HE常规染色的切片上，放射前的宫颈组织可见大量的癌细胞巢状分布，癌细胞呈卵圆形或不规则型，癌细胞增殖旺盛，可见病理性核分裂像，肿瘤间质较少。经15-20次（30-40Gy）的照射后，癌组织明显减少，少数残留的癌细胞呈巢状分布，其间为丰富增生的间质结缔组织，伴有大量的白细胞浸润。

2.2 PCNA免疫阳性反应 在应用特异性第一抗体孵育的切片上，PCNA的免疫反应阳性产物呈深棕色，主要定位于细胞核内，少量阳性产物弥散分布在细胞核膜或核周。在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，未见到PCNA的阳性染色。

2.3 PCNA免疫阳性细胞的分布 放射前宫颈癌组织呈PCNA免疫阳性染色，多数癌细胞呈中等程度的着色，部分免疫染色产物弥散分布在核膜与核周胞质内（Fig1）。放射后的活检组织标本上，残留的癌细胞巢内检测不到明显的PCNA免疫染色，而大量的间质组织细胞显示强阳性的染色（Fig2）。

3 讨 论

以往的研究表明PCNA是真核细胞DNA合成所必需的一种33-36KD的周期蛋白，它是一种DNA聚合酶δ和ε的辅助蛋白，合成于G1和S期，其合成与表达与细胞增殖状态密切相关.PCNA能与几种其他DNA复制与修复因子，如引物识别复合体复制因子C、核酸内切酶Fen-1和DNA连接酶I等结合，参与DNA的复制与修复过程.PCNA在肿瘤组织中的表达有许多报道，其中包括宫颈癌癌前病变和癌组织中的表达。这些研究多认为PCNA的表达可以作为癌细胞增殖状态的生物学标志，即PCNA的表达强，癌细胞的增殖快，反之，则增殖率低.但对于放射对宫颈癌细胞PCNA表达的影响则缺乏研究。有学者研究食管癌放射中PCNA的表达，发现PCNA的表达有变化，并认为在评价放疗效果中有意义。我们的研究结果表明，放射治疗直接杀死癌细胞的同时，可以抑制宫颈癌细胞增殖，这可能是宫颈癌放疗效果较好的原因之一。提示PCNA的表达的变化可以作为宫颈癌放射治疗效果的分子指标。

参考文献

[1] 李玉婷.SCC-Ag在宫颈癌患者术后辅助放疗中的意义[D].新疆医科大学，2008年.

[2] 刘明明，孙胜东，王成林.人宫颈鳞状细胞癌Bcl-2的表达与放射治疗敏感性的关系[J].细胞与分子免疫学杂志，2011年.08期.