脑损伤大鼠脑组织EB含量与Claudin-5表达的分析

张高炼 韦可聪 梁建平 谢伟星 朱云中 梁韡斌 周 庆 张晓宁 龚文劲（广西中医药大学第一附属医院神经外科,广西 南宁 530023）

脑损伤大鼠脑组织EB含量与Claudin-5表达的分析

张高炼 韦可聪 梁建平 谢伟星 朱云中 梁韡斌 周 庆 张晓宁 龚文劲（广西中医药大学第一附属医院神经外科,广西 南宁 530023）

目的研究黄芪对创伤性脑损伤后脑EB含量和紧密连接相关蛋白claudin-5表达的影响。方法采用自由落体致伤原理制成大鼠脑损伤模型，伊文思蓝法检测BBB通透性，Western blot法检测Claudin-5的表达。结果脑损伤模型组及黄芪组BBB通透性于脑损伤后明显增加，同时黄芪组BBB通透性低于脑损伤模型组；Claudin-5的表达在脑损伤模型组和黄芪组于伤后明显减少，黄芪组的表达明显高于脑损伤模型组（P＜0.01）。结论调节紧密连接相关蛋白Claudin-5的表达，进而调节BBB的通透性可能是黄芪抑制脑水肿形成的途径之一。

脑水肿；黄芪；EB含量；Clandin-5

创伤性脑损伤简称TBI,作为临床神经外科中较为常见的一种疾病,其致残率、病死率极高,因此探寻TBI对人体产生的影响有重要意义。目前,临床上对TBI的主要研究机体颅脑遭遇损伤后,其继发性损伤机制的病理性表现。黄芪是我国中医治疗缺血性脑血管疾病时较为常用的一种中药,其具备改善脑部血液微循环、增强抗自由基作用等药理作用已经被现代药理研究证实。而黄芪治疗TBI临床疗效的相关研究文献并不多见,同时药理学关于其作用机制也尚未明确。本文旨在分析黄芪与claudin-5表达之间的关系,现将研究内容报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取

随机挑选70只成年雄性SD大鼠,体质量均在200～260 g之间,选取大鼠均由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2 材料型号

小鼠抗Claudin-5单克隆抗体由Santa Cruz公司生产；实验中使用的戊巴比妥钠由美国Sigma生产；另外伊文思蓝由Evans blue,EB,Fluka公司进口分装；山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的IgG二抗由北京中山生物技术公司生产,黄芪注射液由黑龙江省珍宝岛制药有限公司。

1.3 研究方法

①对照研究:将由广西医科大学动物实验中心提供的70只成年雄性SD大鼠,依据数字标记法随机分成两组,一组为对照组,另外一组为实验组（黄芪组）,两组均给予标准饲料喂养和自由饮水,保持室温（20～25）°C及恒定的湿度。每组在随机分为术后6 h、l d、3 d、5 d、7 d五个时相点,各时间点均取6只大鼠分别进行各项检测。每组大鼠均在术后48 h内取样脑组织,并均给予Claudin-5蛋白表达情况和BBB通透性等检查。②大鼠脑部创伤处理:本文两组大鼠制作的动物模型均参照Feeny等人制作大鼠创伤脑损伤模型方法对大鼠进行处理:依据自由落体的物理原理,制作相关大鼠脑部撞击装置。两组大鼠均给予浓度为4%水合氯醛300 mg/kg进行腹腔麻醉；大鼠在实施麻醉后,将老鼠头部放置在立体定向仪上,并做好固定处理；依据正中线将大鼠头皮切开,并将其骨膜剥离,在前囟后3.5 mm进行标记,并使用牙科台式电钻进行处理,在中线右旁2.5 mm处钻出圆形骨窗,骨窗直径在5 mm左右,并避免对硬脑膜造成损伤；随后让骨窗处与撞击器上的撞杆头保持在同一水平线上,沿外用套管从15 cm高处放下40 g的击锤并撞上击杆,使得大鼠脑部右顶叶局部受到脑挫伤,随后使用牙托粉将骨窗封闭,并缝合大鼠头皮。黄芪组建模前每隔12 h腹腔注射黄芪2.5 g/kg（10 mL/kg）直到相应的时相点,对照组用相同剂量的生理盐水,注射方式为腹腔注射。

1.4 观察指标的测定

①测定EB含量:两组大鼠在处死前1 h,均将浓度2%EB 3 mL/kg在大鼠股静脉处注入；随后采取断头取样大鼠脑组织,并将取样后的脑组织放置于培养皿中,避免水分流失；观察大鼠中心脑组织损伤情况,并取样损伤组织约100 mg,取样承重后将其放置试管中保存,该试管预先注入剂量为3 mL的二甲基甲酰胺；随后将试管放置于温度为60 ℃水浴中,避光,并抽提24 h,离心处理10 min；量取上层离心液,并借助RF-540荧光分光光度计测定EB OD值（荧光光度值）,并选取蒸馏水作为空白对照；依据测定的光密度数值,联系标准曲线对大鼠脑组织中的EB含量进行测定,并以EB含量水平（ug/g湿脑组织）来表现BBB通透性的变化。②大鼠脑组织中Claudin-5的表达:两组大鼠均给予相应时间点大鼠麻醉处理,用生理盐水及4多聚甲醛PBS经心脏灌注后断头取脑,于创伤灶边缘取1 mm×1 mm×1 mm 大小的组织块。并将其放置在浓度、成分均相同的固定液中；固定处理持续2～4 h,随后将处理后的组织块移人浓度为30%的蔗糖PBS缓冲液中,并置于温度为4 ℃冰箱进行保存,直至沉底。沿大鼠创伤灶中心借助冷冻切片机进行连续冠状冷冻切片处理。对每组大鼠采取一张脑切片一个指标的方式进行免疫组织化学分析,并借助200倍光学镜随机对选取创伤灶周边5个相互毫无重叠视野进行观察,每个时间点观察视野共30个,记录每个视野下该指标阳性细胞计数；其中Claudin-5表达蛋白采取1∶500倍进行稀释,而B-actin抗体采取1:5000倍进行稀释,并给予4 ℃孵育过夜处理；同时在二抗室温持续孵育2 h；增强ECL发光（化学荧光反应）,并借助软件Chemi Imager 5500V 2.03对胶片进行扫描,条带积分光密度采取软件Fluor Chem 2.0图像分析仪进行定量分析。

1.5 统计学方法

上述大鼠数据均采取统计学软件SPSS19.0进行分析和处理；数据以均数标准差表示,组间对比采用t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BBB通透性的变化情况

本文研究中借助EB渗透性实验对两组大鼠BBB通透性变化进行评估。各组脑组织EB含量于创伤性脑损伤后72 h时明显升高；与对照组相比,黄芪组大鼠脑组织中EB含量水平明显低于对照组大鼠脑组织EB含量,两组间该项指标对比有统计学意义（P＜0.01）,详细对比见表1。

2.2 脑组织claudin-5蛋白表达变化情况

两组大鼠脑损伤后72 h,均发现Claudin-5蛋白表达含量水平明显减少；黄芪组大鼠中claudin-5蛋白表达明显高于对照组,两组间该项指标对比差异有统计学意义（P＜0.01）,见表1。

表l 两组大鼠ICH后脑组织EB含量及Claudin-5蛋白表达

表l 两组大鼠ICH后脑组织EB含量及Claudin-5蛋白表达

3 讨 论

外伤性急性弥漫性脑肿胀（posttraumatic acute diffuse brain swelling,PADBS）是当今颅脑损伤治疗的难点,有报道其病死率达到65.0%～87.2%[1-2]。研究发现,脑外伤造成的血脑屏障（blood brain barrier,BBB）破坏是产生血管源性脑水肿的主要原因,创伤性脑损伤（TBI）后,其脑组织创伤会使得组织生理性代谢发生变化,进而产生一系列的病理变化,致使BBB的生理结构发生破坏,导致通透性异常增加,BBB结构的完整与否与脑水肿的形成密切相关[3]。

紧密连接由跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架蛋白Actin所组成,紧密连接将内皮细胞的腔面膜和腔对面膜分割开,起到栅栏作用；同时控制细胞旁途径,起到闸门的作用；这也就是说BBB中最重要的结构为紧密连接。而病理学分析发现,Claudins（跨膜蛋白）作为紧密连接中复合物的重要构成成分之一,其参与紧密连接的细胞极化和选择渗透性的维持中[4]。另外,Claudin-5作为大鼠机体脑部组织中调节脑血管内皮细胞膜通透性的主要调节因此,其对BBB通透性的变化和调节起着至关重要的作用[5]。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜英黄芪的干燥根,其主要成分为黄芪皂苷、黄芪多糖、氨基酸、微量元素（硒、锰、铁、锌、铜）和钙等。有研究表明,黄芪皂苷甲能扩张血管,降低周围血管阻力。从药理学的角度证实黄芪具有补气升阳、通经活络、祛除癖滞的作用。黄芪注射液具有扩张血管、降低血压、抗血小板凝集、改善微循环、拮抗氧自由基生成、消除过氧化脂质的作用等,从而保护组织细胞[6]。本研究发现,创伤性脑损伤后72 h,大鼠组织中BBB结构完整度被破坏,导致其通透性异常升高,而在黄芪的作用下,其创伤后脑组织后期的BBB通透性名相下降且明显低于对照组大鼠；同时黄芪组大鼠中Claudin-5表达蛋白水平明显高于对照组大鼠,这说明黄芪有助于TBI后期Claudin-5的表达,进而使得BBB的通透性得到调节,缓解TBI后期的的脑水肿程度。我们推测,黄芪可能通过改善颅脑损伤后脑微循环,清除氧自由基和阻滞神经细胞钙超载,使紧密连接关闭,BBB通透性下降,而发挥减轻脑水肿的作用,其具体作用机制有待进一步研究。

[1] 王泓杰,刘兴渡,王迅.黄芪对大鼠脑刨伤早期保护作用的实验研究[J].中国当代医生,2007,45(15):29-31.

[2] 廖圣芳,王汉东,陈汉民,等.亚低温治疗外伤性弥漫性肿胀的临床研究[J].中国临床医学,2005,12(3):373-375。

[3] 李俊驹,王宇田,黄垂学,等.创伤性脑损伤后AQP4表达与血脑屏障通透性的关系[J].医学临床研究,2009,26(9):1633-1636。

[4] 杨智航,解辉,赵丽妮,等.大鼠创伤性脑损伤后Claudin-5表达水平变化的研究[J].中国当代医药,2011,18(36):25-27.

[5] 刘坤,姚阳.水蛭素对大鼠脑出血后血脑屏障通透性和紧密连接相关蛋白claudin-5表达的作用[J].沈阳医学院学报,2011,13(3):137-139.

[6] 刘建新,王小亚,王晓峰,等.黄芪注射液对颅脑损伤后脑保护作用的实验研究[J].中国中西医结合急救杂志,2008,15(5):266-268.

R651.15

B

1671-8194（2014）25-0087-02

广西教育厅立项项目（编号：201010LX261）