抗病毒中药复方制剂对雏鸡免疫功能影响的研究

2014-05-24周李刘群王赛杨荣康莲莲邱园园韩金潭

西南民族大学学报（自然科学版） 2014年2期

关键词：雏鸡比值淋巴细胞

周李, 刘群, 王赛,杨荣, 康莲莲, 邱园园, 韩金潭

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川成都, 610041)

抗病毒中药复方制剂对雏鸡免疫功能影响的研究

周李, 刘群, 王赛,杨荣, 康莲莲, 邱园园, 韩金潭

(西南民族大学生命科学与技术学院, 四川成都, 610041)

探讨抗病毒中药对雏鸡免疫功能的影响, 为药理作用和临床合理用药提供科学依据.采用水萃取法制备抗病毒中药复方浸膏制剂, 将实验动物随机分为阴性对照组、阳性对照组、低剂量中药组、中剂量中药组和高剂量中药组, 在免疫接种NDV-Lasota株灭活疫苗的基础之上, 以NDV-Ab(鸡新城疫病毒抗体)、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值为检测指标,研究中药复方制剂对雏鸡免疫功能的影响.实验结果表明: 高剂量中药组在连续给药 5d后, 能够促进实验雏鸡在疫苗接种后7-14d的NDV-Ab水平急剧上升, 14d达到最高(27.8073ng/L), 极显著高于阳性对照组的17.8183ng/L(P＜0.01); 3个剂量中药组均能提高实验雏鸡在疫苗接种后7-14d外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+比值的作用, 14d达到最高, 高于阳性对照组(P＜0.05).结论: 抗病毒中药复方制剂具有诱导实验雏鸡体液免疫应答的作用, 诱导作用可能与中药剂量及机体的免疫状态有关.

抗病毒中药复方制剂; 雏鸡; NDV-Ab; CD4+/CD8+

根据中医药理论及病毒性疾病的治疗原则, 以“祛邪”药白花蛇舌草、金银花和“扶正”药黄芪、甘草等组成抗病毒中药复方制剂, 在对兽医临床自然发病的鸡新城疫(ND)、鸡传染性法氏囊病(IBD)、鸭病毒性肝炎(DH)、禽流感H9(AI)、禽肿头综合征等疾病进行治疗并取得了良好效果的基础之上［1］, 为了探讨其抗病毒作用机理, 本研究在 14日龄雏鸡接种 NDV-Lasota株灭活疫苗的情况下, 连续给予不同剂量的抗病毒中药复方制剂, 以NDV-Ab(新城疫病毒抗体)、CD4+/CD8+(CD4+、CD8+T淋巴细胞比值)为检测指标, 研究中药复方对雏鸡免疫功能的影响, 现将研究结果报告如下.

1 材料

1.1 疫苗

NDV油乳剂灭活疫苗, 由华南农业大学生物药品有限公司提供(NDV-Lasota株, 批号: 2012001, 生产日期:20120101).

1.2 实验动物

14日龄青脚麻羽雏鸡, 由成都农业科技职业学院提供.

1.3 受试药物

中药复方制剂由白花蛇舌草、金银花、黄芪、甘草等中药组成.中药饮片购于四川省成都市北京同仁堂,由四川省兽药监察所鉴定.

1.4 主要试剂和仪器

鸡NDV-Ab ELISA试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司, 201202); 鸡外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司, 20111201); FITC和 R-PE荧光标记小鼠抗鸡的 CD4+和 CD8+单克隆抗体(SouthernBiotech, C1706-FN70E、G149-VJ39V); Aria II分选型流式细胞仪(美国, BD); 抗凝剂(EDTA-2Na); 超速离心机(德国, Eppendorf); Synergy HT多功能酶标仪(美国, BioTek)等.

2 方法

2.1 中药复方口服液的制备

将中药饮片混合, 参照江平康等[2]水萃取工艺: 浸泡0.5小时、12倍加水量、煎煮3次、煎煮时间1小时,水提浸膏收率为57.2%, 换算成生药含量并分别制成2g/ml、1g/ml、0.5g/ml的口服液, 4℃冰箱保存.

2.2 实验动物分组及处理

14日龄青脚麻羽雏鸡150只, 随机分成5组, 每组30只.各组处理如下:

阴性对照组: 按0.5ml/只颈部皮下注射灭菌生理盐水, 常规饲喂.

阳性对照组: 按0.5ml/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗, 常规饲喂.

高剂量中药组: 按0.5ml/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗, 同时按4g(生药)/kg(体重)/天拌料口服中药复方口服液, 连续服用5天.

中剂量中药组: 按0.5ml/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗, 同时按2g(生药)/kg(体重)/天拌料口服中药复方口服液, 连续服用5天.

低剂量中药组: 按0.5ml/只颈部皮下注射NDV油乳剂灭活疫苗, 同时按1g(生药)/kg(体重)/天拌料口服中药复方口服液, 连续服用5天.

2.3 检测指标

2.3.1 NDV-Ab测定

实验动物在分组和处理前随机抽取5只雏鸡, 翅静脉采血各1.5ml; 疫苗接种及处理后的第7、14、21、28d,即 14、21、28、35、42日龄, 每组随机抽取 5只雏鸡、翅静脉采血各 1.5ml, 血液室温自然凝固 10-20min后,2000-3000rpm离心20min, 收集血清, 供NDV-Ab的测定.NDV-Ab的测定参照鸡NDV-Ab ELISA试剂盒使用说明书进行.

2.3.2 CD4+/CD8+T淋巴细胞的检测

实验动物在分组和处理前随机抽取 6只雏鸡, 翅静脉采血各 2ml; 疫苗接种及处理后的的第 7、14、21、28d, 即14、21、28、35、42日龄, 每组随机抽取6只雏鸡, 翅静脉采血各2ml, EDTA-2Na抗凝, 加入2mlPBS液稀液并混匀, 按照鸡外周血淋巴细胞分离、鸡 CD4+和 CD8+单克隆抗体试剂盒使用说明书及流式细胞仪操作规程检测CD4+、CD8+T淋巴细胞的含量, 并计算其比值.

2.3.3 实验数据的处理

3 结果与分析

3.1 对雏鸡NDV-Ab效价的影响

3.1.1 NDV-Ab标准品结果

NDV-Ab标准品结果见表1, 图1

表1 NDV-Ab标准品吸光值(450nm)Table1 Absorbance of NDV-Ab standard product(450nm)

图1 NDV-Ab标准曲线Fig1 NDV-Ab standard curve

标准曲线是以标准品浓度由低到高, 从左至右作为横坐标X轴, 450nm下读取的各检测孔O.D值作为纵坐标Y轴, 在Logit-Log直线回归模式下绘制的曲线.该曲线相关系数(R2)为0.9864, 已达到实验要求(＞0.92), 表示标准曲线方程可用.

3.1.2 各组实验动物组内NDV-Ab水平的变化情况

各组实验动物组内NDV-Ab水平的动态变化情况见表2

表2 各组实验动物组内NDV-Ab水平的动态变化值(ng/L, ±Se, n﹦5)Table2 Dynamic change value of NDV-Ab in each group(ng/L , ±Se, n﹦5)

注: 同行右肩有相同小写字母的数据表示无显著差异, P>0.05; 完全无相同字母的数据表示有显著差异, P<0.05; 同行右肩有相同大写字母的数据表示无极显著差异, P＞0.01; 完全无相同字母的数据表示有极显著差异, P＜0.01.Note: The dates with different lowercases within a row means significant difference(P＜0.05); and the same lowercase mean no significant difference(P＞0.05); The date with different uppercases within a row means most significant difference(P＜0.01); and the same lowercase mean no most significant difference(P＞0.01).

表2表明: 阴性对照组在实验第7d(21日龄), NDV-Ab有所下降(0.01＜P＜0.05), 之后NDV-Ab开始上升并维持至42日龄, 高于实验前和实验后第7d的水平(P＜0.01); 其它各组在注射疫苗后第7d, NDV-Ab变化不大,之后开始上升, 其中阳性对照组NDV-Ab在免疫后的14d至28d维持在一个较高的水平, 均极显著高于实验前和免疫后的第 7d(P＜0.01); 高剂量中药组和低剂量中药组在免疫后的第 14d, NDV-Ab水平急剧升高(P＜0.01),之后虽明显下降(P＜0.01), 但仍明显高于(P＜0.01)实验前和免疫接种后的第7d的NDV-Ab水平; 中剂量中药组在免疫接种后 14d, NDV-Ab水平明显升高(P＜0.01), 之后抗体水平走势与阳性对照组相似.实验表明: 高剂量中药组在连续给药5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后14d的NDV-Ab水平急剧升高, 之后虽有所下降, 但仍极显著高于接种前的水平.

3.1.3 各组实验动物组间NDV-Ab水平的动态变化情况

各组实验动物组间NDV-Ab水平的动态变化情况见表3

表3 各组实验动物组间NDV-Ab水平的动态变化值(ng/L, ±Se, n﹦5)Table3 Dynamic change value of NDV-Ab with each group(ng/L , ±Se, n﹦5)

注: 同列右肩有相同小写字母的数据表示无显著差异, P>0.05; 完全无相同字母的数据表示有显著差异, P<0.05; 同列右肩有相同大写字母的数据表示无极显著差异, P＞0.01; 完全无相同字母的数据表示有极显著差异, P＜0.01.Note: The dates with different lowercases within a row means significant difference(P＜0.05); and the same lowercase mean no significant difference(P＞0.05); The date with different uppercases within a row means most significant difference(P＜0.01); and the same lowercase mean no most significant difference(P＞0.01).

表3表明: 免疫后第7d, 低剂量中药组NDV-Ab水平均显著高于其它实验动物组(P＜0.05); 免疫后第14d,除中剂量中药组外, 其它各组 NDV-Ab水平均高于阴性对照组, 差异极显著(P＜0.01), 尤其是高剂量中药组NDV-Ab水平同时高于阳性对照组和低剂量中药组, 差异极显著(P＜0.01); 免疫后第21天, 除中剂量中药组外,其它各组 NDV-Ab水平均显著高于阴性对照组(P＜0.05), 且高剂量组差异达到极显著水平(P＜0.01), 高剂量中药组和低剂量中药组水平相当, 虽与中剂量中药组无极显著差异(P＞0.01), 但仍具有统计学意义(P＜0.05); 免疫后第28天, 高剂量中药组NDV-Ab水平高于其它各组, 差异极显著(P＜0.01), 其他各组间均无显著差异(P＞0.05).实验表明: 高剂量中药组在连续给药5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后14d的NDV-Ab水平急剧升高, 极显著高于阳性对照组(P＜0.01), 之后虽有所下降, 但仍然高于阳性对照组和中、低剂量中药组的NDV-Ab水平(P＜0.05).

综合以上分析, 结合各组实验动物NDV-Ab水平变化折线图2.

图2 各组实验动物NDV-Ab水平的动态变化折线图Fig2 The line graph of dynamic Change of NDV-Ab with each group

实验结果表明: 高剂量中药组在连续给药 5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后 7-14d的NDV-Ab水平急剧升高, 免疫14d后达到最高(27.8073ng/L), 极显著高于阳性对照组的17.8183ng/L, 之后虽有所下降, 但仍然高于阳性对照组和中、低剂量中药组的 NDV-Ab水平(P＜0.05), 表明大剂量的抗病毒中药复方制剂具有促进实验雏鸡在接种新城疫疫苗后新城疫抗体生成的作用.

3.2 对雏鸡CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的影响

3.2.1 各组实验动物组内CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的变化情况

各组实验动物组内CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的动态变化情况见表4

表4 各组实验动物组内CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的动态变化值(±Se, n﹦6)Table4 Dynamic change value of CD4+/CD8+Tlymphocytes in each group(±Se, n﹦6)

表4表明: 阴性对照组, 在实验第7d, CD4+/CD8+T淋巴细胞并没有显著变化, 第14d比值显著上升(P＜0.01)并维持在较高的状态, 与实验前差异极显著(P＜0.01); 阳性对照组, 免疫接种后第7d, CD4+/CD8+T淋巴细胞比值极显著上升并达到最高峰, 维持到免疫接种后的 14d, 差异极显著(P＜0.01), 之后略有下降, 但仍显著高于实验前的水平(P＜0.05); 3个中药剂量组在免疫接种后第7d, CD4+/CD8+T淋巴细胞开始上升并达到最高峰, 差异极显著(P＜0.01), 其中高剂量中药组和中剂量中药组在免疫接种后第 14d有所下降, 但仍极显著高于实验前水平(P＜0.01), 低剂量中药组在免疫接种后第14d, CD4+/CD8+T淋巴细胞比值开始下降, 到免疫接种后的21d与实验前的 CD4+/CD8+T淋巴细胞比值无统计学意义(P＞0.05).实验结果表明: 大剂量的中药复方制剂具有极显著提高实验雏鸡在接种新城疫疫苗后第7d外周血淋巴细胞(PBL)CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的作用.

3.2.2 各组实验动物组间CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的变化情况

各组实验动物组间CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的动态变化情况见表5

表5 各组实验动物组间CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的动态变化值(±Se, n﹦6)Table 5 Dynamic change value of CD4+/CD8+Tlymphocytes with each group(±Se, n﹦6)

表5表明: 实验第7d, 阳性对照组和3个中药剂量组, CD4+/CD8+T淋巴细胞比值和阴性对照组相比较, 差异极显著(P＜0.01); 免疫接种后第14d, 阳性对照组和中、低剂量中药组CD4+/CD8+T淋巴细胞水平与阴性对照组相比较, 差异极显著(P＜0.01),高剂量中药组具有统计学意义(P＜0.05); 免疫接种后第21d, 阳性对照组、低剂量中药组CD4+/CD8+T淋巴细胞水平高于阴性对照组, 但没有统计学意义(P＞0.05), 高剂量中药组、中剂量中药组与阴性对照组相比较, 差异显著(P＜0.05), 且中剂量中药组差异极显著(P＜0.01); 免疫接种后第 28d, 除中剂量中药组外, 其它各组与阴性对照组均没有显著差异(P＞0.05), 中剂量中药组差异极显著(P＜0.01).实验结果表明: 中药组在连续给药5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后7-14d的CD4+/CD8+T淋巴细胞水平升高, 免疫后 14d达到最高, 之后虽有所下降, 但仍然高于阴性对照组, 尤其是中剂量中药组的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值高于阳性对照组的水平(P＜0.05).

综合以上分析, 结合各组实验动物CD4+/CD8+T淋巴细胞比值变化折线图3.

图3 各组实验动物CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的动态变化折线图Fig3 The line graph of dynamic Change of CD4+/CD8+T lymphocytes with each group

实验结果表明: 3个剂量中药组在连续给药 5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后 7d的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值水平升高并高于阳性对照组, 之后虽略有下降, 但中剂量中药组的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值仍高于阳性对照组并且维持到免疫接种后的第 28d.表明抗病毒中药复方制剂具有提高鸡的高抗体免疫应答过程中 CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的作用, 并预示这种作用可能与药物剂量和机体的免疫状态等因素有关.

4 讨论与结论

本研究采用鸡NDV-Ab-ELISA法测定血清标本中鸡NDV-Ab水平: 用纯化的鸡NDV抗原包被微孔板制成固相抗原, 依次与NDV-Ab和与HRP标记的鸡NDV抗原结合, 形成抗原-抗体-酶标抗原复合物, 加底物TMB显色, 颜色的深浅与样本中NDV-Ab呈正相关, 通过标准曲线计算出样品中鸡NDV-Ab的浓度(ng/L).实验结果表明: 高剂量中药组在连续给药5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后7-14d的NDV-Ab水平急剧升高, 免疫14d后达到最高(27.8073ng/L), 极显著高于阳性对照组的17.8183ng/L, 之后虽有所下降, 但仍然高于阳性对照组和中、低剂量中药组的NDV-Ab水平(P＜0.05), 表明大剂量的该中药复方制剂具有促进实验雏鸡在接种新城疫疫苗后新城疫抗体生成的作用.

CD4和CD8分子是动物白细胞表面重要的分化抗原, 主要分布在 T淋巴细胞的表面, 作为免疫粘附因子,通过MHC的限制性, 在鸡的免疫应激和疾病感染过程中发挥着重要作用[3].CD4抗原是Th(辅助性T细胞)的重要表面标志, 能识别结合在 MHC-Ⅱ类抗原上的异抗原, 分泌多种淋巴因子(如巨噬细胞游走抑制因子, 淋巴毒素, γ-干扰素等), 既能辅助B淋巴细胞产生体液免疫应答, 又能辅助T细胞产生细胞免疫应答, 是扩大免疫应答的主要成分; CD8抗原是Tc细胞(细胞毒性T细胞)的重要表面标志, 能识别结合在MHC-Ⅰ类抗原上的异抗原,能特异地杀伤靶细胞, 是细胞免疫应答的主要成分.在鸡的高抗体免疫应答过程中CD4T淋巴细胞比例高, CD4＋/CD8＋比值增加, 在低抗体免疫应答过程中CD8T淋巴细胞比例高, CD4＋/CD8＋比值下降[4].CD4和CD8作为T淋巴细胞表面重要的标记分子, 目前主要采用基于标记的单克隆抗体的流式细胞术和免疫组化法对CD4、CD8T淋巴细胞进行定量检测[5].

本实验对雏鸡CD4+/CD8+T淋巴细胞水平的研究结果表明: 免疫接种后第7-14d, 阳性对照组和高、中、低剂量中药组, CD4+/CD8+T淋巴细胞比值和阴性对照组相比较差异显著(P＜0.01、P＜0.05), 说明接种NDV-Lasota油乳剂灭活疫苗后引起机体体液免疫应答为主; 免疫接种后第21d, 阳性对照组、低剂量中药组CD4+/CD8+T淋巴细胞水平虽然高于阴性对照组, 但无统计学意义(P＞0.05), 高剂量中药组、中剂量中药组与阴性对照组相比较,差异显著(P＜0.05), 且中剂量中药组差异极显著(P＜0.01); 免疫接种后第 28d, 除中剂量中药组外, 其它各组与阴性对照组比较均没有显著差异(P＞0.05), 中剂量中药组差异极显著(P＜0.01)并显著高于阳性对照组, 实验结果说明中药组在连续给药5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后7-14d的CD4+/CD8+T淋巴细胞水平升高, 免疫后 14d达到最高, 之后虽有所下降, 但仍然高于阴性对照组, 尤其是中剂量中药组的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值高于阳性对照组的水平(P＜0.05).

综合实验数据分析: 3个剂量中药组在连续给药 5d后, 能够促进实验雏鸡在接种新城疫灭活疫苗后 7d的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值水平升高并高于阳性对照组, 之后虽略有下降, 但中剂量中药组的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值仍高于阳性对照组并且维持到免疫接种后的第 28d.表明该中药复方制剂具有提高鸡的高抗体免疫应答过程中CD4T淋巴细胞比例的作用, 并预示这种作用可能与药物剂量和机体的免疫状态等因素有关.

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[2]江平康, 刘群, 杨松沛, 等.中药复方总化学成分(浸膏)提取工艺研究[J].中国畜牧兽医, 2011, 38(7): 242-245.

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[4]PARMENTIER H K,KREUKNIET M B,GOEREE B, et al.differences in distribution of lymphocyte antigens in chicken.Lines divergently selected for antibody responses to sheep red blood cells[J].Vet Immunol,1995,48:155-168.

[5]岳华, 黄兴, 杨发龙, 等.荧光定量RT-PCR检测鸡CD4、CD8基因表达水平[J].畜牧兽医学报, 2008, 39(6): 784-790.

Research on the effect of the antiviral Chinese herbal compound on the immune function of the chicks

ZHOU Li, LIU Qun, WANG Sai, KANG Lian-lian, YANG Rong, QIU Yuan-yuan, HAN Jin-tan
(College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

This paper studies the effect of the Chinese herbal compound on the immune function of chicks, which would provide some references for its pharmacological research and its safe and logical clinical medication.The water extraction method was adopted to produce Chinese herbal compound extractum, and different doses of extractum were mixed with fodder to feed the chicks.All the experimental animals were divided into five groups: positive control group, low dose group, midst dose group, high dose group, and negative control group.After they were immunized with inactivated vaccine of NDV-Lasota,NDV-Ab, CD4+/CD8+were taken as the testing indexes to study the effect of the Chinese herbal compound on immunity function of the chicks.The results showed that: the level of NDV-Ab of high dose group rose sharply between 7thand 14thday,and by the 14thday it reached the highest level of 27.8073ng/L, which was significantly higher than that of control group(17.8183ng/L)(P＜0.01).The level of CD4+/CD8+in all the three different does groups rose, and reached the highest level on 14thday, which was higher than that of control group (P＜0.05).Conclusion: Chinese herbal compound could induce the humoral immune response, while this effect could be relative with the factors of drug dosage and immune state.

Antiviral Chinese herbal compound; chick; NDV-Ab; CD4+/CD8+

S853.7

1003-4271(2014)02-0179-07

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.02.04

2013-12-19

刘群(1965-), 男, 博士, 副教授, Email: liuqun2567@qq.com.

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD34B02-4); 中央高校基本科研业务费科研建设平台(11NPT03).