广西眼镜蛇毒Natrin对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

徐星新，蒋兴明，梁永红，王志清，马兴才，李映新，宋 慧

(1广西医科大学，南宁530021;2南宁市第七人民医院)

蛇毒具有多种生物活性，目前关于蛇毒蛋白抗肿瘤的报道越来越多，但其单一成分抗肿瘤作用的研究仍然比较少，且作用机制尚不明确［1，2］。近年来的研究发现，富含半胱氨酸分泌蛋白(CRISPs)广泛存在于一些爬行动物、软体动物的毒液中，具有先天宿主免疫和离子通道抑制等多种功能。Natrin是从广西眼镜蛇蛇毒中分离得到的一种CRISPs［3］，具有抗脂质过氧化、阻断 Ca2+通道的作用［4，5］，但其抗肿瘤作用却鲜有报道。2012年12月～2013年10月，我们观察了Natrin对人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌SKOV3细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，由广西医科大学细胞培养室传代培养;广西眼镜蛇毒冻干粉由广西医科大学蛇毒研究所提供;多用电泳仪购于美国BIORAD公司，流式细胞分析仪购于美国BECKMAN COULTER公司。

1.2 方法

1.2.1 Natrin的分离与细胞培养 参照蒋兴明等［6］的方法分离 Natrin，经 SDS-聚丙烯酞胺凝胶还原电泳检测Natrin蛋白的分子量，其分子量为25 Ku，纯度符合标准。SKOV3细胞用含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液，于37℃、5%CO2孵育箱中培养，生长旺盛的细胞每2～3 d传代1次。

1.2.2 细胞生长抑制率测算 采用MTT法。取对数生长期的SKOV3细胞株，按每孔2.0×104接种于96孔板，培养24 h后，弃上清液。观察组加入终浓度为1.25、6.25、12.5、62.5、125、200、250 mg/L的Natrin液100μL，对照组加入等体积的培养液，每组设6个复孔。培养24 h后，采用酶标仪测定592 nm波长下各孔吸光度(A)值，计算抑制率、IC50。抑制率 =(A对照组－A观察组)/A对照组×100%。

1.2.3 细胞凋亡形态观察 取对数生长期的细胞，按每瓶5.0×105接种于25 cm2培养瓶中，培养24 h后，观察组分别加入终浓度为6.25、12.5 mg/L的Natrin液3 mL，对照组加入等体积的培养液。继续培养24 h，取出细胞消化，离心，弃上清，PBS洗涤2次;3%戊二醛固定2 h以上，0.1 mol/L PBS洗涤3次;1%锇酸固定2 h，0.1 mol/L PBS洗涤3次。梯度浓度乙醇、丙酮脱水，环氧树脂618浸透包埋，徕卡UC7超薄切片机超薄切片，醋酸铀—柠檬酸铅双重染色，10 000倍透射电子显微镜下观察细胞凋亡形态。

1.2.4 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术检测。取对数生长期的细胞株，按每孔2.0×105接种于6孔板，待细胞贴壁后弃去旧培养液，观察组加入终浓度为6.25、12.5、25.0、62.5 mg/L 的 Natrin 溶液200 μL/孔，每组设3个复孔，对照组加入等体积培养液。置培养箱培养24 h后，消化收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次;4℃，1 000 r/min离心10 min;用结合缓冲液调整细胞为1.0×106/mL。取190μL细胞悬液置于流式管中，加入标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的磷酯酰丝氨酸结合蛋白V(Annexin V)5μL，碘化丙啶(PI)5μL，混匀室温下避光孵育5 min，立即上流式细胞仪分析，根据AV-FITC/PI染色情况确定正常、早期凋亡、晚期凋亡或坏死细胞，计算细胞早、晚期凋亡率。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Natrin 对 SKOV3 细胞增殖的影响 1.25、6.25、12.5、62.5、125、200、250 mg/L 的 Natrin 作用 SKOV3 细胞24 h 生长抑制率分别为13.24% ±0.01%、22.60%±0.01%、47.94% ±0.01%、67.73% ±0.01%、80.21%±0.03%、87.88% ±0.01%、88.94% ±0.01%，不同浓度间比较，P均＜0.01。Natrin作用SKOV3细胞24 h的 IC50为26.13mg/L。

2.2 Natrin对SKOV3细胞凋亡形态的影响 观察组出现了明显的凋亡形态，核染色质固缩成数个大小不等的块状，有些边集，有些分散在核的中部;核膜褶皱，胞质浓缩;细胞器正常且分布相对集中，胞质中偶见空泡。对照组无明显凋亡形态，核膜与细胞膜较完整，无内陷、褶皱;核染色质分布均匀，无固缩、边集现象。见插页Ⅲ图5。

图5 透射电镜下观察被Natrin作用24 h后SKOV3细胞的凋亡形态（×10 000）

2.2 Natrin对SKOV3细胞凋亡的影响 观察组随着Natrin浓度增加，早、晚期和总凋亡率逐渐增大，早期凋亡率均高于晚期凋亡率，P均 ＜0.01。见表1。

表1 Natrin对SKOV3细胞凋亡的影响(%，±s)

表1 Natrin对SKOV3细胞凋亡的影响(%，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01;与同浓度组早期凋亡率比较，#P＜0.01

组别 n 早期凋亡率 晚期凋亡率 总凋亡率观察组3 3 1.15 ±0.16 2.01 ±0.49 3.16 ±0.64 6.25 mg/L 10.97 ±1.83* 5.16 ±0.40*# 16.10 ±1.44*12.5 mg/L 23.19 ±0.92* 8.60 ±0.66*#31.70 ±0.88*25.0 mg/L 31.58 ±1.46*20.38 ±1.22*# 51.90 ±0.41*62.5 mg/L 33.03 ±1.78*24.15 ±1.46*# 57.10 ±2.44*对照组

3 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，在妇科恶性肿瘤中排第三位，但其病死率占妇科肿瘤的首位，对女性的生命安全造成严重威胁。化学药物治疗卵巢癌作用确切，疗效显著，但不良反应大、长期应用易产生耐药性等［7］。近年来，肿瘤学家们发现肿瘤的发生和发展与细胞凋亡密切相关［8～10］。许多抗肿瘤药物通过干扰肿瘤细胞的生长、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的［11］。而且在诱导凋亡的过程中，凋亡细胞很快被体内的巨噬细胞清除，周围的炎症反应很少。

研究证实，蛇毒蛋白具有多种药理活性，Natrin是从广西眼镜蛇毒中分离得到的，可能也具有潜在的抗肿瘤活性。研究发现，广西眼镜蛇毒蛋白Natrin在体外能抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡［12］。Natrin的抗肝癌作用被证实，提示其很可能具有抗人卵巢癌的活性。本研究发现，在透射电镜下观察组细胞呈现典型的细胞凋亡形态，而对照组细胞则无明显细胞凋亡形态;随着Natrin浓度的增加，人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制率和早晚期凋亡率均明显增加，且早期凋亡率明显高于晚期凋亡率，提示可将其开发成肿瘤细胞凋亡触发型药物。本研究发现，Natrin作用SKOV3细胞24 h的IC50为26.13 mg/L，与单用顺铂时的IC50很接近［13，14］，表明SKOV3 细胞对 Natrin 较敏感。因此，选择合适的给药时间与较低的给药浓度能有效诱导细胞凋亡，为其进一步开发成临床抗肿瘤药物提供了良好的条件。

总之，Natrin在一定浓度下能抑制人卵巢癌SKOV3细胞生长并诱导其发生凋亡，而这种作用具有剂量依赖性。至于Natrin诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的分子生物学机制和最佳给药时间、给药浓度等还有待进一步研究。

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