人结肠癌HT-29移植瘤不同生长阶段微血管密度及相关因子的表达研究

白丽淼，黄晓峰，徐寒梅

（1.中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京 210009；2.南京市口腔医院病理科，江苏南京 210008）

新生血管对于肿瘤的生长和转移是必不可少的［1］。肿瘤的血管新生是一个受到多种因子共同作用的复杂过程。肿瘤组织内血管的增生情况反映了肿瘤诱导血管新生的能力，检测肿瘤的微血管密度（microvessel density，MVD），作为反映肿瘤血管生长的指标，具有重要意义［2］。CD105为一种同源异体细胞膜糖蛋白，是TGF-β受体复合物成分之一。有研究表明，CD105可特异性地表达于高增殖状态的血管内皮细胞［3］。血管内皮生长因子（VEGF）能够增加血管通透性，促进内皮细胞分裂、增殖、血管构建、迁移，对肿瘤的新生血管生成起着决定性作用，是目前已知最关键的促进血管生成因子［4］。缺氧是肿瘤发生恶性转化和肿瘤转移的起始因素，缺氧诱导因子HIF-1α在肿瘤血管的生成过程中起着重要的调控作用。缺氧通过两种方式促进血管生成：一方面HIF-1α可直接增加促进血管生长的因子表达，如促进 VEGF、VEGFR1、IL-8、血管生成素（angiogenin）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）的表达，以促进内皮细胞的增殖及血管生成；另一方面缺氧可降低血管生成抑制因子的活性，为血管新生提供合适的环境［5］。

肿瘤的发生和发展是多阶段性的连续过程，肿瘤组织在不同时期存在特定的微环境［6］。而血管在肿瘤生长不同时期是否存在不同的特征尚未见报道。本实验应用免疫组化方法研究了不同体积的HT-29裸鼠移植瘤组织内 CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表达情况，以探讨肿瘤不同阶段的微血管密度和血管相关因子的表达，为血管生成抑制剂类抗肿瘤药物的合理用药提供依据。

1 材料与试剂

1.1 实验动物及细胞株 实验动物为BALB／c裸小鼠，SPF级，5～7周龄，♀，体质量（15±2）g，购自常州卡文斯实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK（苏）2011-0003。人结肠癌细胞HT-29购自中国科学院细胞库。

1.2 主要试剂 DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司）；青霉素、链霉素（美国Amresco公司）；HIF-1α和VEGF一抗均为兔抗人单克隆抗体，CD31和CD105一抗均为鼠抗人单克隆抗体，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；免疫组化试剂盒（鼠兔通用）购自Dako公司。

2 方法

2.1 裸鼠移植瘤实验 复苏冻存的HT-29细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。收集生长对数期细胞，将细胞浓度调整为每毫升2.5×107个细胞，接种于BALB／c裸小鼠右侧前肢腋部皮下，每只小鼠接种0.2 ml。2周后15只裸鼠全部成瘤。根据移植瘤生长情况将15只荷瘤裸小鼠按照肿瘤大小分为3组，每组5只。3组移植瘤的大小分别为＜100 mm3、100～300 mm3、＞300 mm3。

2.2 免疫组化检测 免疫组化采用Envision两步法。所有标本均经中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋、3 μm连续切片、脱蜡，EDTA pH 8.0高温抗原修复，滴加相应一抗，4℃过夜，PBS洗涤后加二抗37℃孵育，DAB显色，苏木精复染，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶进行封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知的阳性切片作为阳性对照。

2.3 结果判定 ①微血管密度的计数：肿瘤组织中的微血管均染为棕黄色，阳性定位在血管内皮细胞的细胞膜和细胞质。按Weidner法［7］对MVD进行计数，即先在低倍镜（×100）下查看整张切片，找到肿瘤组织的微血管密集区，再在高倍镜（×200）下选择5个视野计数血管数，取其平均值作为此样本的MVD值。任何一个被染为棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇，只要与相邻的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织界限分明，都被认为是一个微血管，进行计数。管腔大于8个细胞或带有较厚肌层的血管不计数；②VEGF表达的判定：细胞的细胞质或细胞膜出现黄色或棕黄颗粒为阳性表达，400倍镜下随机取5个不同视野，分别计数整个视野内阳性细胞数和总细胞数，取其比值作为阳性表达率，5个数值的平均值作为该样本的阳性表达率；③ HIF-1α表达的判定：阳性表达于细胞核，计数方法同VEGF。

2.4 统计学处理 利用SPSS 13.0统计分析软件进行统计。数据以¯x±s表示，组间差异的比较采用配对样本t检验。

Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages（±s，n＝5）

Tab 1 Expression of vascular-related factors for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages（±s，n＝5）

*P＜0.05，**P＜0.01 G1 vs G2，and G2 vs G3

Group Tumor volume／mm3 CD31-MVD CD105-MVD VEGF expression／% HIF-1αexpression／%G1 ＜100 37.40±4.17 22.80±3.54 26.20±0.83 3.20±2.97 G2 100～300 18.80±1.72** 15.60±1.35* 40.73±6.29** 11.89±1.94**G3 ＞300 14.20±2.23* 10.20±2.48* 13.41±1.20** 80.62±3.47**

Fig 1 Expression of CD31 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

3 结果

3.1 染色结果 CD31阳性表达于血管内皮细胞的细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒。在肿瘤组织内的微血管和大血管上均有表达，与其他组织可清晰分辨（Fig 1）。CD105也将血管内皮细胞染为棕黄色，与CD31比较，多染色于微小血管上，血管内皮细胞排列不规则，与其他组织可清晰分辨。在大血管上染色不明显，分布不均匀，肿瘤组织的边缘区表达强烈（Fig 2）。VEGF阳性表达于肿瘤细胞的细胞质中，表现在肿瘤细胞的胞质内出现棕黄色颗粒。在肿瘤组织内间质细胞的细胞质也有表达（Fig 3）。HIF-1α阳性表达定位于肿瘤细胞的细胞质，染为棕黄色。在肿瘤组织的坏死区及其边缘表达明显（Fig 4）。

3.2 肿瘤不同阶段 CD31、CD105、VEGF、HIF-1α的表达 从Tab 1可以看出，随着肿瘤体积的增大：① CD31-MVD值分别为 37.40±4.17、18.80±1.72、14.20±2.23，CD105-MVD值分别为22.80±3.54、15.60±1.35、10.20±2.48。即体积增大，组织内微血管密度减小，各组间t检验结果显示P＜0.05，差异有显著性；裸鼠移植瘤不同体积时CD31-MVD、CD105-MVD的变化趋势见Fig 5；②VEGF阳性表达率先增后减，分别为 26.20% ±0.83%、40.73%±6.29%、13.41%±1.20%。肿瘤体积在100～300 mm3时表达最多，体积继续增大，VEGF的阳性表达率减小；③ 组织内部的坏死程度逐渐加大，HIF-1α的阳性表达增加，分别为 3.20% ±2.97%、11.89%±1.94%、80.62%±3.47%。特别是在坏死区域和坏死边缘区域，HIF-1α的阳性表达明显。裸鼠移植瘤不同体积时VEGF、HIF-1α的阳性表达变化见Fig 6。

Fig 2 Expression of CD105 for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 3 Expression of VEGF for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 4 Expression of HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stagesHT-29 xenografts tumor volumes A：＜100 mm3，B：100～300 mm3，C：＞300 mm3

Fig 5 CD31-MVD and CD105-MVD for xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages

4 讨论

早在20世纪初，Goldman就发现了血管围绕肿瘤生成的现象。1971年，Folkman提出肿瘤的生长、转移与血管生成密不可分。在无血管状态下，肿瘤的营养获得来源于简单的被动扩散，肿瘤生长直径不会超过2 mm。新生血管给肿瘤带来了丰富的营养物质和氧气，并将肿瘤细胞与循环系统联系到一起，为肿瘤转移提供机会［8］。肿瘤血管已经成为研究的热点，是最有希望的肿瘤导向治疗的靶标。

CD105又名 Endoglin，是调节转化生长因子-β（TGF-β）受体复合物成分之一。定位于人染色体9q34，分子质量为180 ku。TGF-β能降低毛细血管样结构的长度，并且可诱导缺乏CD105的内皮细胞死亡。抑制人内皮细胞中CD105蛋白的翻译，可增强TGF-β对内皮细胞生长和游走的抑制功能，说明CD105可抑制TGF-β的生物学效应［9］。有研究表明，CD105在多种实体瘤上高度表达，其与病人的生存率和转移率密切相关。黄小娟等［10］实验表明，MVD-CD105与组织学分级、腹水、有无远处转移和淋巴结转移有关。CD105表达越高，肿瘤组织学分级越高，肿瘤患者的预后越差。CD105可优先表达于肿瘤的新生血管内皮细胞上，相对于Von Willebrand因子、CD31和CD34更具特异性，对肿瘤血管的诊断具有更高的参考价值［11］。在本研究中也发现了相似的现象，CD105的阳性表达集中在肿瘤的边缘区，在移植瘤不同体积时，阳性染色多为单层内皮细胞围成的管腔。而在移植瘤体积大于300 mm3的样本中，用CD31标记的血管出现分支和大血管。从数量上比较，HT-29裸鼠移植瘤在不同时期CD105-MVD、CD31-MVD值差异均存在显著性（P＜0.01）。

肿瘤的血管生成与其所处的微环境中血管形成因子有关。VEGF是一种重要的促进血管生成因子。VEGF通过与受体KDR特异性结合，发挥其对内皮细胞的促进分化和趋化作用，从而促进血管新生，所以研究肿瘤组织中VEGF的表达情况具有重要意义。在本实验中我们发现，不仅肿瘤细胞表达VEGF，间质细胞也大量表达。HT-29裸鼠移植瘤在不同体积时，VEGF的表达量不同。在肿瘤体积小于300 mm3时，VEGF的表达量较高，当肿瘤体积继续增大时，VEGF的表达量减少。所以在肿瘤体积较小时应用VEGF抑制剂类抗肿瘤药物，可能会获得好的疗效。

Fig 6 Expression of VEGF and HIF-1αfor xenografts tumor of HT-29 cells in nude mice at different growth stages

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β组成的具有转录活性的异源二聚体。其中HIF-1β在细胞内稳定表达，HIF-1α在氧压正常时被蛋白酶迅速降解，而在缺氧时，其半衰期延长，与HIF-1β结合成一个完整的HIF-1转录子，调控缺氧相关基因的表达，所以HIF-1α为HIF的氧调节亚单位［12］。在HT-29裸鼠移植瘤不同瘤体积时检测HIF-1α的表达，我们发现，随着肿瘤体积的增大，肿瘤坏死面积增加，HIF-1α的表达率升高。在肿瘤组织的坏死区域及边缘区，HIF-1α明显表达。肿瘤体积增大，肿瘤组织内血管密度减少，供血不足导致组织得不到充足的氧气和养分，出现缺氧，常规药物无法进入组织内部，难以达成治疗效果。

肿瘤的生长和转移不仅与肿瘤细胞本身有关，与其所处的微环境也密不可分。肿瘤微环境是指肿瘤在生长过程中，由肿瘤细胞、基质细胞（成纤维细胞、免疫细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞等）和细胞外基质等共同组成的肿瘤发生、发展和转移的局部稳态环境，是肿瘤生理学、结构和功能的一个组成部分［13］。从本实验中我们可以发现，HT-29裸鼠移植瘤在不同体积时，肿瘤组织内各种细胞因子的表达情况不同。所以在肿瘤治疗时，肿瘤微环境为一个重要的考量因素。

恶性肿瘤是一个多因素、多基因、多阶段的病理过程。在肿瘤不同阶段，基因组、转录组、蛋白质组学呈现不同的规律［14］。只有给予适时的、恰当的药物治疗，才能达到预期的治疗效果。血管抑制剂类药物虽然在临床上取得了巨大的成功和销售利润，但其开发历史相对其他肿瘤化学治疗药物较短，其药理学研究还不够深入，非常有必要在其临床药理或临床前药理学方面进行深入的研究，以便为其更合理使用提供重要参考。在给予血管生成抑制剂类抗肿瘤药物时，一定要考虑到肿瘤所处的阶段，只有在肿瘤发生发展恰当的时期给予相应的、恰当的抗肿瘤药物治疗，才可能达到预期的效果。在肿瘤的治疗中应注意：（1）研究不同肿瘤、肿瘤不同时期的微环境，从而采取个性化治疗方案；（2）以肿瘤的微环境为靶点，开发多靶点药物或多种干预手段联合应用，从而取得期待的治疗或预后。本文结果说明，在肿瘤分化早期，CD31-MVD、CD105-MVD、VEGF的表达水平高，此时给予相应的血管抑制剂治疗会收效明显；在肿瘤分化中晚期，肿瘤组织内部缺氧程度增加，HIF-1α过度表达，此时给予 HIF-1α抑制剂，如p300／CBP抑制剂JG-ODN、sGC刺激剂YC-1、HSP90抑制剂等对于改善组织缺氧状态，抑制肿瘤生长和抑制血管生成具有重要意义［15］。

参考文献：

［1］ Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent［J］？J Natl Cancer Inst，1990，82（1）：4-6.

［2］ Schimming R，Reusch P，Kuschnierz J，et al.Angiogenic factors in squamous cell carcinoma of the oral cavity：do they have prognostic relevance［J］.JCraniomaxillofac Surg，2004，32（3）：176-81.

［3］ Takase Y，Kai K，Masuda M，et al.Endoglin（CD105）experssion and angiogenesis status in small cell lung cancer［J］.Pathol Res Pract，2010，206（11）：725-30.

［4］ Mäkinen T，Veikkola T，Mustjoki S，et al.Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth，survival and migratory signals via the VEGF-C／D receptor VEGFR-3［J］.EMBO J，2001，20（17）：4762-73.

［5］ Ruan K，Song G，Ouyang G.Role of hypoxia in the hallmarks of human cancer［J］.J Cell Biochem，2009，107（6）：1053-62.

［6］ Hanahan D，Weinberg R A.Hallmarks of cancer：the next generation［J］.Cell，2011，144（5）：646-74.

［7］ Weidner N，Semple J P，Welch W R，et al.Tumor angiogenesis and metastasis——correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med，1991，324（1）：1-8.

［8］ Folkman J.Tumor angiogenesis：therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285（21）：1182-6.

［9］ Li C，Hampson I N，Hampson L，et al.CD105 antagonizes the inhibitory signaling of transforming growth factor betal on human vascular endothelial cells［J］.FASEB J，2000，14（1）：55-64.

［10］黄小娟，齐文慧，王 立，等.CD31和CD105在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床病理意义［J］.中国组织化学与细胞化学，2012，21（6）：544-50.

［10］Huang X J，Qi WH，Wang L，et al.Expression and clinicopathological significance of CD31 and CD105 in ovarian epithelial carcinoma［J］.Chin J Histochem Cytochem，2012，21（6）：544-50.

［11］ Dallas N A，Samuel S，Xia L，et al.Endoglin（CD105）：a marker of tumor vasculature and potential target for therapy［J］.Clin Cancer Res，2008，14（7）：1931-7.

［12］李玉娟，刘建勋.HIF-1活性调节及其在缺血后血管新生中的作用［J］.中国药理学通报，2009，25（1）：19-20.

［12］Li Y J，Liu JX.Key regulators of HIF-1 and its action in angiogenesis after ischemia［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（1）：19-20.

［13］Mbeunkui F，Johann D J Jr.Cancer and the tumor microenvironment：a review of an essential relationship［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2009，63（4）：571-82.

［14］李夏雨，沈守荣，武明花，等.对基因遗传性肿瘤不同阶段转录组学调控规律及其分子机制［J］.中南大学学报（医学版），2011，36（7）：585-91.

［14］Li X Y，Shen SR，Wu M H，et al.Transcriptomic regulation and molecular mechanism of polygenic tumor at different stages［J］.J Cent South Univ（Med Sci），2011，36（7）：585-91.

［15］吴 琪，霍兴华.以HIF-1α为靶点的抗肿瘤药的研究现状［J］.齐齐哈尔医学院学报，2011，32（7）：1119-21.

［15］Wu Q，Huo X H.Drugs development in anti-tumor therapy by targeting of HIF-1α［J］.J Qiqihar Med Coll，2011，32（7）：1119-21.