鸡鸭免疫禽流感Re-6疫苗后的抗体监测

黄宝学，韦显凯，梁素联，班雪花²，黄美娜

（1.广西田东县动物疫病预防控制中心，广西 田东 531500； 2.广西动物疫病预防控制中心，广西 南宁 530001；3.广西大学动物科技学院，广西 南宁 530004）

高致病性禽流感是由正粘病毒科A 型流感病毒引起的一种禽类急性传染病，可感染几乎所有野生禽和家禽，严重影响养禽业的健康发展，被世界动物卫生组织（OIE）定为名录传染病，我国政府将其列为一类传染病[1]。疫苗免疫是预防和控制禽流感发生的最有效途径，而免疫后抗体水平的高低是评估实际免疫效果的重要指标[2]。目前报道较多的是对某个地区的禽流感免疫抗体的监测[3，7]，然而对于家禽群的母源抗体情况，家禽的品种对抗体影响等很少进行分析。为了掌握禽流感灭活疫苗在田东县当地家禽品种的不同注射部位产生的免疫应答和抗体消长情况，提供可操作的免疫方法和免疫程序。特进行本次试验研究，供广大养殖户和动物防疫工作者参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验疫苗

重组禽流感灭活疫苗（H5亚型，Re-6株，批号2012053），哈尔滨维科生物技术开发公司生产。

1.1.2 试验鸡、鸭群分组及免疫注射部位及免疫次数情况

选用14日龄田东本地土鸡400只，分为4组，其中颈部皮下注射2组，胸部肌肉注射2组。选用14日龄田东本地土鸭400只，分为4组，其中颈部皮下注射2组，大腿部肌肉注射2组。共8个组，试验期84天。 其中，每种动物的两个注射部位分别设一免和二免各两组（详见表1）。

表1 实验动物分组情况

1.1.3 试验鸡、鸭群免疫时间和免疫剂量情况

2013年5月1日对14日龄的鸡鸭8个试验组进行第一次免疫，免疫剂量按疫苗说明书使用，鸡0.3mL/只，鸭0.5mL/只。5月28日对42日龄的鸡鸭8个试验组进行第二次免疫，免疫剂量按疫苗说明书使用，鸡0.5mL/只，鸭1mL/只（详见表1）。

1.1.4 血清样品

对8个试验组鸡群和鸭群一次免疫后，7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d分别随机采集血清各5份，二次免疫后，7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d的 各 组分别随机采集血清各5份，共计血清样品320份。

1.1.5 诊断试剂

禽流感病毒H5亚型HI试验抗原（H5亚型）由哈尔滨维科生物技术开发公司生产（批号2013002），H5亚型阳性血清（批号2013001）由哈尔滨维科生物技术开发公司生产，1%的非免鸡红细胞自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫方法

鸡1-4组在14日龄免疫注射疫苗0.3mL，鸡2组和4组42日龄免疫注射疫苗0.5mL。鸭5-8组在14日龄免疫注射疫苗0.5mL，鸭6组和8组42日龄免疫注射疫苗1mL。

1.2.2 采血部位

21日龄以下的鸡鸭在心脏采血，28日龄以上的鸡鸭在颈静脉采血。

1.2.3 检测方法

按照 GB/T18936—2003 颁布的高致病性禽流感诊断技术方法，用 96 孔微量反应板进行微量血凝抑制（Heamoglutination Inhibition，HI）试验，试验用抗原稀释倍数为4HAU，以完全抑制 4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 滴度。并按常规方法设置阴性和阳性对照。

1.2.4 结果判定

只有阴性对照孔血清滴度不大于22 ，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于22判定HI试验阴性；HI价等于23为可疑，需重复试验；HI价大于或等于24 为阳性，判为免疫合格。

1.2.5 数据分析方法：采用SPSS statistics 17.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同种类动物抗体产生结果

鸡和鸭同时进行禽流感疫苗免疫后，鸡群H5抗体阳性率为74.38%，鸭为86.88%，鸭的合格率高于鸡，差异极其显著（P<0.01）（详见表2）。

表2 不同种类动物抗体产生结果

2.2 不同免疫部位对家禽H5抗体效价的影响

在鸡鸭的颈部皮下和肌肉进行禽流感疫苗免疫注射后，颈部皮下注射和肌肉注射的抗体合格率分别为79.38%和81.88%，差异不显著（P>0.05），两组注射部位对家禽H5抗体效价产生没有大的影响（表3）。

表3 不同免疫部位对抗体产生的影响

2.3 不同免疫部位和次数的抗体效价分布情况

通过表2和表3可知，鸡鸭二免后抗体合格率为97.5%，而一免的只有63.75%，差异极其显著（P<0.01）。通过比较不同免疫部位和次数的抗体效价分布情况，发现二免后的鸡鸭禽流感抗体平均滴度为8.8075，比一免的4.6725高4.125个滴度，详见表4。

表4 荧光定量RT—PCR和普通RT－PCR的敏感性试验

通过绘制鸡、鸭一免和二免后的抗体消长规律，发现鸭一免后21天抗体可以达到合格水平，一直持续到56天抗体均合格。而鸡在一免后28天抗体方能合格，并且持续到一免后56天均合格。而不管是鸡和鸭在二免后的各个时间点采血，抗体均维持高水平，详见图1和图2。

图1 鸡一免和二免抗体产生消长图

3 讨论与结论

当前，为使我国高致病性禽流感疫情的发生得以有效控制，有关部门启动了一系列综合生物安全体系，其中疫苗免疫是防止禽流感暴发的主要措施。因此，我们进行了禽流感灭活疫苗对鸡鸭的抗体产生规律的探索，为制定禽流感免疫程序和防治禽流感提供科学依据[4]。鸭类等水禽的免疫系统与鸡有很大的区别，不能简单地将鸡的免疫应答规律类推到鸭等水禽上，因为他们对相同的抗原产生的免疫应答可能有很大的区别[5]，所以本次实验对本地土鸭和鸡的抗体产生规律进行了对比。

据相关资料报道[6]，鸭和鹅免疫抗体和鸡相比相对较低。但本研究发现，本地土鸭的高致病性禽流感H5抗体产生效果优于鸡，这是否和鸡鸭的品种、饲养条件和饲养环境对禽流感抗体的产生有直接的关联，或者用鸡的红细胞作为鸭禽流感抗体滴度测定是否有影响[7]，水禽血清中可能存在某种非特异性凝集因子，对鸡红细胞有非特异性凝集作用，这都有待进一步研究。

图2 鸭一免和二免抗体产生消长图

家禽的不同免疫部位对免疫操作的可操作性及工作效率有一定的影响，但对禽流感抗体产生是否有影响的报道较少，本次实验发现鸡鸭的颈部皮下注射和胸部肌肉注射的抗体产生差异不显著，用两种方法均可进行。实践中，颈部皮下注射比较容易操作，42日龄以下的鸡鸭一个人可以完成免疫注射工作，注射时用左手拇指和食指把颈部后1/3处皮肤捏起使皮肤和肌肉分离，右手持注射器针头朝背部方向，以小于30°的角度刺入捏起的皮下，即可完成。胸部肌肉注射时，须两人操作来完成，一人保定，一人注射。并且禽流感疫苗是油剂苗，肌肉注射会引起注射部位肿胀、吸收不快，严重时可导致家禽逐渐消瘦、死亡等免疫副反应发生。进针过深，还刺破肝脏导致禽只死亡。

不同的免疫次数对抗体产生效果有较大的差别。本研究发现，家禽进行一次免疫后，21天起平均抗体滴度能达到4log2以上，但抗体合格率基本在40-60%，而二次免疫后，能达到95%左右。在对家禽进行首次免疫后由于免疫系统是初次应答，加上母源抗体的干扰，因而抗体效价普遍低；而商品肉鸡鸭、蛋鸡、种鸭由于在首次免疫后，机体对此种疫苗已具有免疫记忆，当再次用此种疫苗进行加强免疫时，机体可迅速产生比上次免疫更多的抗体，故抗体的效价普遍较高[8]。但在生产中：一方面，很多养殖户防疫意识不强，认为由于饲养周期短，免疫过一次就可以达到预防目的，对防疫人员进村入户开展二免不配合不支持，产生抵触情绪；另一方面，在给家禽注射疫苗时，由于一只一只抓捉和注射疫苗时疼痛与疫苗的副作用，家禽应激反应很大，可导致生产性能下降和饲养成本的增加。家禽只进行一次免疫，必然造成抗体滴度较低的现象，难以保护家禽群体，潜在受野毒攻击暴发疫情的威胁。应加大对养殖户和防疫员的培训力度，强化防疫意识，确保免疫质量。

结合本试验研究结果，推荐田东县本地鸡鸭在14日龄首次免疫重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株），颈部皮下注射鸡0.3mL，鸭0.5 mL；42日龄二次免疫重组禽流感灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株），颈部皮下注射鸡0.5mL，鸭1 mL，使鸡、鸭群在较长时间内保持较高的抗体水平。本研究采用的两次免疫的时间间隔为1个月，对于不同的免疫间隔时间对抗体产生的研究在后续实验中将进一步研究。

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[3]肖康，周碧君，王开功，等.贵州省禽流感免疫抗体监测结果分析[J].畜牧与兽医 2011，43（1）：51-54.

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[5]黄建龙，刘道新.禽流感防控的探讨[J].养禽与禽病防，2012，5：4-5

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[7]朱燕秋，张济培，谢海燕，等.水禽禽流感HI抗体检测方法的探讨[J].广东畜牧兽医科技 2008，33（4）：18-19.

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