桑黄胞外多糖发酵条件优化研究

程俊文，侯寒黎，邹景泉，贺 亮*，李肖娟

（1. 浙江省林业科学研究院 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023；

2. 萧山出入境检验检疫局，浙江 杭州 311208；3. 杭州雪域生物技术有限公司，浙江 杭州 311200；）

桑黄胞外多糖发酵条件优化研究

程俊文1，侯寒黎2，邹景泉1，贺 亮1*，李肖娟3

（1. 浙江省林业科学研究院 浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，浙江 杭州 310023；

2. 萧山出入境检验检疫局，浙江 杭州 311208；3. 杭州雪域生物技术有限公司，浙江 杭州 311200；）

在单因素试验的基础上，通过Box-Benhnken组合设计和响应曲面分析法优化桑黄（Phellinus igniarius）液体发酵产胞外多糖的发酵工艺条件，结果表明：桑黄胞外多糖的最佳液体发酵培养条件为葡萄糖15.82 g/L，玉米粉10.51 g/L，豆饼粉9.55 g/L；此条件下的验证试验表明，此时胞外多糖的得率为461.72 mg/L，与理论值基本吻合。

桑黄；发酵；胞外多糖；Box-Behnken；响应面；

桑黄（Phellinus igniarius）俗称桑黄菇、桑臣、桑耳等，是一种珍贵的大型药用真菌。目前，桑黄是国际公认的生物抗癌领域中效果最好的真菌[1]。桑黄具有抗癌、抗炎、抗氧化、提高免疫力、保肝护肝等多种药用功效[2~3]，现代药理学研究表明，三萜、多糖和黄酮类物质是其关键药性成分[4]。目前，桑黄在国际市场上供不应求，野生桑黄资源有限，桑黄的人工栽培研究在国内又刚刚起步，因此，采用液体发酵技术进行桑黄的规模化生产具有广阔的前景。

响应曲面法（response surface methodology，RSM）是建立一个包括各因素的一次项、平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型。近年来日益受到重视，采用该方法可以建立连续变量曲面模型，对影响生物产量的因子水平及其交互作用进行优化与评价，从而快速有效地确定生物过程的最佳条件，目前已广泛用于发酵培养基优化、培养条件优化和酶解等生化反应优化和模型建立中[5~6]。本实验以桑黄胞外多糖为目标产物，利用Box-Behnken设计和响应面法优化发酵培养基组成来提高桑黄液体发酵胞外多糖的产量，为以后的发酵和放大实验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

桑黄由浙江省林业科学研究院生物技术研究所实验室保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面PDA 用于活化菌种。

1.2.2 液体种子培养基 马铃薯100 g/L，葡萄糖15 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.2.3 摇瓶发酵基础培养基 葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面培养 从母种试管中切出蚕豆大小的菌丝块接种于斜面的中部，在26℃培养7 d。

1.3.2 液体种子培养 将活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种于液体培养基中，500 mL三角瓶装培养基150 mL于28℃，150 r/min培养6 d。

1.3.3 发酵培养 采用二级摇瓶，500 mL三角瓶装液量150 mL，液体菌种接种量为10%，于25℃、150 r/min培养。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验 以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、小麦粉取代摇瓶发酵培养基中的葡萄糖，分别进行碳源种类试验；以酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、麦麸、牛肉浸膏取代酵母粉，分别进行氮源种类试验；以10 ~ 30 g/L葡萄糖进行碳源浓度梯度试验，以2 ~ 16 g/L的酵母粉进行氮源浓度梯度试验。

1.4.2 响应面法分析实验 综合单因素试验结果，选择葡萄糖、玉米粉、豆饼粉3个因素所确定的水平范围，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理[5]，采用3因素3水平的响应面设计，利用Design Expert 8.05软件对实验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以－1、0、1进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis g·L－1

1.5 分析方法

1.5.1 菌丝干重测定 取100 mL发酵液，在3 000 r/min离心20 min，自来水洗涤多次后，将菌丝体在105℃烘干至恒重，电子天平称重。

1.5.2 胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）的测定 收集发酵液，3 000 r/min离心20 min，取上清液，浓缩，加入3倍体积的95%酒精，4℃冰箱醇沉24 h，4 000 r/min离心20 min得沉淀物，用硫酸—苯酚法测定其多糖的含量[6]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

表2 不同碳源和氮源对桑黄液体发酵胞外多糖的影响Table 2 Effect of carbon and nitrogen resource on EPS

由表2、表3可知：葡萄糖、玉米粉和蔗糖都是较好的碳源，其含量对桑黄胞外多糖的积累随着浓度的增加而增大，继续增大则趋于平稳；从生产实际考虑，选择葡萄糖和玉米粉作为桑黄液体发酵培养基的复合碳源。酵母粉和豆饼粉都是较好的氮源，其含量对多糖的积累随着浓度的增大而增大，继续增到一定值反而降低；从生产实际考虑，豆饼粉价格低廉，容易获得，因此选择豆饼粉作为桑黄液体发酵培养基的氮源。

表3 起始碳源浓度和氮浓度对菌丝体生物量和胞外多糖产量的影响Table 3 Effect of initial glucose concentration on EPS

2.2 响应面分析试验结果

2.2.1 响应面分析方案及结果 根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验。共有17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验用以估计试验误差。以胞外多糖得率为响应值，试验方案及结果见表4。

表4 响应面试验设计方案及试验结果Table 4 Design and results of RSM

2.2.2 回归模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05软件对表6实验数据进行分析[7]，获得桑黄胞外多糖得率对葡萄糖、玉米粉和豆饼粉的多元二次回归方程：

由表7可知，以胞外多糖含量为目标函数的回归方程回归效果达到极显著水平，P值均＜0.000 1；模型的决定系数R2= 0.990 2，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数AdjR2= 0.977 5，说明该模型能解释97.75%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表7中模型失拟项的P值为0.092 7，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表 7的显著性分析结果，各因素的一次项、二次项以及X1X2、X1X3、X2X3的交互项对胞外多糖的合成均显著（p＜0.05）影响；综合以上表明这个模型建立的回归方程能运用于桑黄液体发酵培养基优化的理论预测。

表5 回归模型方差分析Table 5 ANOVA on regression model

2.2.3 响应面图形分析 分别将模型中的葡萄糖、玉米粉及豆饼粉的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图1、图2、图3所示，各个因素及其相互间的交互作用对响应值的影响结果通过该组图可以直观地反映出来。极值条件应该在等高线的圆心处。由几组图可以看出，影响桑黄发酵产胞外多糖最显著的因素为葡萄糖（X1），表现为响应面变化弧度较大。玉米粉（X2）和豆饼粉（X3）响应面弧度变化平缓，说明对响应值影响相对较小。

此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图1至图3可以看出，X1与X3、X2与X3、X1与X2交互作用显著。

图1 葡萄糖和玉米粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图Figure 1 Response surface and contour for EPS as a function of glucose and corn meal

图2 葡萄糖和豆饼粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图Figure 2 Response surface and contour for EPS as a function of glucose and soybean cake powder

图3 玉米粉和豆饼粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图Figure 3 Response surface and contour for EPS as a function of corn meal and soybean cake powder

2.2.4 验证实验 通过SAS软件对上述方程进行求解，得到最佳培养条件为：葡萄糖15.82 g/L，玉米粉10.51 g/L，豆饼粉9.55 g/L，胞外多糖产量理论值可达476.99 mg/L。

为检验模型预测值与实际实验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对桑黄在预测的最优发酵条件下胞外多糖产量进行实验验证。实验中葡萄糖、玉米粉和豆饼粉的优化值分别为15.82、10.51、9.55 g/L，3组平行实验，测得胞外多糖产量分别为469.36、462.64、453.18 mg/L，实际胞外多糖平均值为461.72 mg/L，达到了回归模型预测理论值的 96.8%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测桑黄胞外多糖产量。

3 结论

考察了不同碳、氮源营养因子的影响，结合工业化生产实践，选择葡萄糖和玉米粉为碳源，豆饼粉为氮源，根据Box-Benhnken中心组合实验设计及三因素三水平的响应面分析，通过二次多项回归模型进行方差分析和回归拟合，预测了桑黄产胞外多糖最佳培养基条件为：葡萄糖15.82 g/L、玉米粉10.51 g/L、豆饼粉9.55 g/L，胞外多糖产量理论值可达476.99 mg/L。验证实验中胞外多糖可得461.72 mg/L，与预测值十分接近，证明了该实验方法的稳定性。

[1] 戴玉成. 药用担子菌: 鲍氏层孔菌（桑黄）的新认识[J]. 中草药，2003，34（1）：94－95.

[2] Li Ge, Kim D H, Kim T D, et al. Protein-bound polysaccharide from Phellinus linteus induces G2/M phase arrest and apoptosis in SW480human colon cancer cells[J]. Cancer Lett, 2004, 216（2）：175－181.

[3] Shone M Y, Kim T H, Sung N J. Antioxidants and free radical scavenging activity of Phellinus baumii (Phellinus of Hymenochaetaceae) extracts[J]. Food Chem, 2003, 82（4）：593－597.

[4] 吕英华，王建芳，李玉平，等. 药用真菌桑黄的研究进展[J]. 蚕业科学，2009，35（1）：204－210.

[5] Liang Renjie. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydr Polym, 2008（74）：858－861.

[6] 王光亚. 保健食品功效成分检测方法[M]. 北京：中国轻工业出版社，2002.

[7] 费荣昌. 实验设计与数据处理（第四版）[M]. 无锡：江南大学出版社，2001.

Experiment on Fermentation Technology for Production of Extracellular Polysaccharides from Phellinus igniarius

CHENG Jun-wen1，HOU Han-li2，ZOU Jing-quan1，HE Liang1*，LI Xiao-juan3
（1. Zhejian g Fo restry Academy, Key Laborato ry o f Biological an d Chemical Utilization of Forest Resources, Hangz hou 3100 23, Chi na; 2. Xiaoshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of Zhejiang, Hangzhou 311208, China; 3. Hangzhou Xueyu Biology Technology Corporation, Hangzhou 311200, China）

Analysis of three-level Box-Behnken factorial design with response surface methodology (RSM) was conducted on fermentation technology for extracellular polysaccharides (EPS) production from Phellinus igniarius based on single factor experiment. The result showed that the optimal fermentation conditions were as follows: glucose 15.82 g/L, corn meal 10.51 g/L and soybean cake powder 9.55 g/L. Verification test demonstrated that the average yield of EPS was 461.72 mg/L, similar to theoretical value of 476.99 mg/L.

Phellinus igniarius; fermentation; extracellular polysaccharide; Box-Behnken; response surface methodology (RSM)

S759.81

A

1001-3776（2014）05-0016-05

2014-05-20；

2014-08-11

浙江省科技厅院所专项（2012F30037）；浙江省科技厅院所专项（2014F50018）；杭州市农业科研攻关专项（20120232B48）

程俊文（1981－），男，安徽芜湖人，硕士，助理研究员，主要从事林源中药活性成分开发研究；*通讯作者。