江西地区汉族精神分裂症与短串联重复序列D6S285和D6S296多态性的关联分析*

余波，李悦，朱春潮，杨晓红，章洁，袁也丰，罗达亚△，徐方云△

(南昌大学1基础医学院，2公共卫生学院，3第一附属医院精神卫生科，江西南昌 330006)

江西地区汉族精神分裂症与短串联重复序列D6S285和D6S296多态性的关联分析*

余波1，李悦2，朱春潮1，杨晓红1，章洁1，袁也丰3，罗达亚1△，徐方云1△

(南昌大学1基础医学院，2公共卫生学院，3第一附属医院精神卫生科，江西南昌 330006)

目的:分析临床患者短串联重复(STR)序列D6S285和D6S296的基因多态性与精神分裂症的关联性，探讨精神分裂症发病学的分子机制。方法：选取江西地区汉族精神分裂症患者100例为病例组，健康人群100例为对照组，采集血液样本抽提DNA;采用毛细管电泳技术检测分析STR位点D6S285和D6S296的各等位基因的分布，综合运用多种遗传学分析方法统计分析检测结果。结果:(1)对照组D6S285和D6S296各等位基因频率符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05);(2)病例组D6S285-206等位基因的检出率为6.60%，明显低于对照组的13.70%(P＜0.05)，其相对危险度OR=0.448(OR＜1);病例组D6S285-212等位基因的检出率为82.70%，明显高于对照组的73.20%(P＜0.05)，其OR=1.748(OR＞1);(3)在D6S296位点上共检测到18种等位基因，各等位基因的检出率在两组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论:人类6号染色体短臂上的D6S285位点附近可能存在与精神分裂症有关联的微效基因。

精神分裂症;短串联重复;基因多态性

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是人类最常见、最严重的精神性疾病［1］，发病率约为1%，主要表现为思维、情感与行为障碍以及精神活动与社会不协调。该病病程迁延反复，病后患者的学习、工作与生活均受到显著影响，给社会和家庭带来沉重的负担。大量的证据已表明，遗传因素是精神分裂症的主要病因，其遗传度约为60%～85%［2］，且属多基因遗传。此外还有众多影响因素如人体必需微量元素的含量等［3］。由于存在生活和社会环境、不完全外显以及遗传异质性等诸多复杂因素的影响，至今对其易感基因及患病风险位点的定位仍不明确［4-7］。从已有的研究看，除少数可重复的阳性结果，如5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)受体、多巴胺D2(dopamine D2)受体基因多态性与精神分裂症的关联性已被多家研究机构证实［8］外，更多的是一些相互矛盾或不一致的研究结果。这些相互矛盾的结果也更进一步说明了该病的异质性和作为多基因遗传的复杂性。

为了探究精神分裂症的致病基因，世界各地的研究者付出了极大的努力。大量基因组扫描研究显示:除了19号、21号和Y染色体以外，其余的染色体上都可能含有SZ的易感基因。近年来，国内外学者对精神分裂症与6号染色体的关系尤其关注，且对6p22～24区域的研究中有较多的阳性报道［6-7］。

本实验所检测的2个位点D6S285与D6S296均位于第6号染色体的6p22～24区域。之所以选择这2个侯选位点进行精神分裂症的关联研究，主要的理由是:(1)该区域已成为近年来众多学者研究精神分裂症易感基因的热点区域。章洁等［9］在2010年的一项实验研究中发现，人类6号染色体上D6S289及D6S1610两位点可能与精神分裂症相关联，这2个位点均位于6p22～24区域;张咸宁等［10］和陈建芳等［11］的研究也提出了慢性精神分裂症可能与人类6号染色体上D6S296位点关联的证据;Moises等［12］对精神分裂症的家系研究结果证实，在染色体6p区具有遗传标记连锁位点，有部分中国人精神分裂症患者在D6S285处存在连锁，但在欧洲人种中并未发现相应的遗传标记连锁位点。(2)到目前为止，国内外对D6S285和D6S296这2个微卫星标志与精神分裂症关系的研究报道不多，而有关江西省汉族精神分裂症与6号染色体上D6S285短串联重复(short tandem repeat，STR)序列关联性的研究迄今尚未见报道，故本实验具有一定的创新性。

本研究采用STR技术，以江西地区汉族精神分裂症患者为研究对象，以健康人群为对照，检测其血液标本第6号染色体短臂上D6S285和D6S296各等位基因的频率分布，探讨基因多态性与精神分裂症的关系，以期阐明精神分裂症发病学的分子机制。

材料和方法

1 研究对象

1.1 精神分裂症组精神分裂症组病例均来自江西省精神病专科医院2010年至2011年间的住院患者，共收集精神分裂症病例100例，其中男性54例，女性46例，平均年龄为(35.2±6.9)岁。

1.1.1 患者纳入标准病例诊断按照国际疾病分类标准第10版精神分裂症争端标准(International Classification of Disease，10th Revision，ICD-10)，并参照中国医学会精神科分会2001年出版的《中国精神障碍分类与诊断标准》第3版。无器质性精神障碍及其它精神疾病，病程在3个月以上。本实验收集的样本主要来自江西汉族地区年满14～55岁的患者，同意参加本研究并取得病人及家属或法定监护人的同意(签署知情同意书并取得伦理委员会的同意)。

1.1.2 排除标准诊断不明确;伴有严重的躯体疾病和脑器质性疾病;精神发育迟缓、痴呆患者;有乙醇依赖和其它药物依赖史;父辈、祖辈近亲结婚或迁移入江西居住者。

1.2 健康人群对照组健康人群对照组全血标本均来自南昌大学第一附属医院检验科，系同一时期健康成人送检的标本。共收集样本100例，其中男性58例，女性42例，平均年龄(39.5±8.3)岁。

1.2.1 纳入标准患者均来自于江西汉族地区并同意参加本次研究;本人及一级亲属无精神疾病及自杀史;无药物依赖史及其它严重躯体疾病;志愿者间无亲属关系。

1.2.2 排除标准资料不齐全或者不愿意参加本次研究者。

2 方法

2.1 血液标本的采集与处理对符合入组标准的患者和对照组志愿者在征得其知情同意后，用含有EDTA抗凝的真空采血管抽取外周静脉血3 mL，-20℃保存。

2.2 DNA提取采用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)提取各样品基因组DNA。

2.3 引物设计与配制通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov等人类基因组数据库和Primer3软件(http://www.sagb.co.uk)，设计各微卫星位点的荧光引物:D6S285位点5＇端标记N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(N，N，N'，N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine，TAMRA)，D6S296位点5＇端标记6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6FAM)，均委托上海生工公司完成。D6S285上游引物5＇-TAMRA-TGTGAAATGGAGAATGACACAGACA-3＇，下游引物5＇-TCCAATAGAAATCAAGCCCTGGTT-3＇;D6S296上游引物:5＇-6FAM-TCTATCCCAGGTTTCTCCAA-3＇，下游引物5＇-GCTTCATCTATAATCAAGACACTCA-3＇。

2.4 PCR扩增扩增体系:总体积20 μL，其中含有TaKaRa Taq(5×106U/L)0.1 μL、10×PCR Buffer 2.0 μL、dNTP 1.6 μL、DNA模板2 μL、上下游混合荧光引物1 μL和双蒸水13.3 μL。反应条件:95℃变性5 min，分别为95℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃10 min。

2.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定取PCR产物5 μL，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，以20 bp DNA Ladder Marker为分子量标准品(有13条带，其中100 bp、200 bp 和500 bp 3条为指示带，显示亮带)。电泳完毕后用Bio-Rad凝胶成像分析系统进行照相和保存。

2.6 毛细管电泳PCR产物的毛细管电泳按本实验设计的要求，委托上海生工生物工程有限公司完成。

3 统计学处理

首先对检测结果进行哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡检验，确定候选基因各个位点分布符合Hardy-Weinberg平衡定律;再采用SPSS 16.0统计软件进行数据的运算与处理，得出各等位基因的频率，将病例组与对照组的各频率进行组间比较分析，以P＜0.05为差异有统计学意义;最后计算相对危险度，OR=［Pd×(1-Pc)］/［Pc×(1-Pd)］(Pd为患者组基因频率，Pc为对照组基因频率)，OR＞1时判为有易感倾向，OR＜1时判为有抗性倾向。

结果

1 对照组D6S285和D6S296各等位基因Hardy-Weinberg平衡分析

经哈迪-温伯格平衡检验，健康对照组人群D6S285和D6S296位点上各等位基因频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，表明所选择的个体达到遗传平衡。

2 D6S285和D6S296各等位基因检出率及与SZ的关联分析

(1)精神分裂症病例组和健康对照组检出D6S285共有7种等位基因，其片段大小在206～220 bp之间，具体琼脂糖电泳和毛细管基因分型见图1、2。经卡方检验分析后发现其中有2个等位基因频率存在显著差异，见表1。病例组D6S285位点206等位基因的检出率为6.60%，对照组为13.70%，2组比较差异显著(P＜0.05)，其OR=0.448(OR＜1);病例组D6S285位点212等位基因的检出率为82.70%，对照组为73.20%，2组比较有显著差异(P＜0.05)，其OR=1.748(OR＞1);后采用精确概率法加以验证，发现上述2个阳性位点P值均为0.027(P＜0.05)，其余5个等位基因的检出率经组间比较均无显著差异(P＞0.05)。(2)2组检出的D6S296共有18种等位基因，其片段大小在258～296 bp之间，具体琼脂糖电泳和毛细管基因分型见图3、4。各等位基因检出率在2组间比较，均无显著差异(P＞0.05)。在剔除不符合要求的研究数据后，我们又选择了11个D6S285和D6S296的相关等位基因进行单倍体分析，单倍型频率的比较采用精确概率法，结果亦无阳性发现，见表3。

Figure 1.The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products of D6S285 in the case group.M:DNA marker;1～7:the samples of the PCR amplification products.图1 病例组D6S285位点PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱

Figure 2.The capillary electrophoresis figure of the D6S285-212 alleles in the case group.图2 病例组D6S285位点212 bp等位基因片段毛细管电泳图

表1 精神分裂症与正常对照人群D6S285等位基因的关联分析Table 1.The linkage analysis of the D6S285 alleles between the schizophrenia group and the control group

Figure 3.The agarose gel electrophoresis of the PCR amplification products of D6S296 in the case group.M:DNA marker;1～7:the samples of the PCR amplification products.图3 病例组D6S296位点DNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱

讨论

本实验选择的研究区域为第6号染色体的6p22～24区域，所检测的2个位点D6S285与D6S296均位于此，其中D6S285是位于第6号染色体短臂上6p22～24区域内一段短串联重复序列。本研究观察到2组的D6S285位点共检出7种等位基因，其片段大小介于206～220 bp之间。通过采用2种不同的统计学分析方法均发现其中有2种等位基因频率存在显著差异，具体为:(1)精神分裂症组D6S285位点206等位基因的检出率显著低于对照组，其OR值为0.448(OR＜1)，关联分析提示D6S285上206等位基因位点附近可能存在精神分裂症的保护基因;(2)精神分裂症组D6S285位点212等位基因的检出率显著高于对照组，其OR值为1.748(OR＞1)，关联分析强烈提示D6S285的212等位基因位点附近可能存在精神分裂症的易感基因。本片段的其它5个等位基因检出率在2组间比较均无显著差异(P＞0.05)。该位点的检测分析结果与Moises等［12］的报道相似，表明江西地区汉族精神分裂症人群的D6S285位点附近可能存在与精神分裂症有关联的微效基因。

Figure 4.The capillary electrophoresis figure of the D6S296-264 and-274 alleles in the case group.图4 病例组D6S296位点264 bp及274 bp等位基因片段毛细管电泳图

表2 精神分裂症患者与对照人群D6S296等位基因的关联分析Table 2.The linkage analysis of the D6S296 alleles between the schizophrenia group and the control group

表3 精神分裂症与正常对照人群D6S285与D6S296相关等位基因的单倍型分析Table 3.The haplotype analysis of the D6S285 and D6S296 alleles between the schizophrenia group and the control group

D6S296也是位于第6号染色体短臂6p22～p24区域上的一段短串联重复序列，不同国家和地区对于该位点的研究报道均有所差异。Straub等［13］、张咸宁等［10］和陈建芳等［11］的研究认为慢性精神分裂症可能与人类6号染色体上D6S296位点相关联，但本研究的结果与他们的报道并不一致。本研究观察到D6S296共有18种等位基因，其片段大小介于258～296 bp之间，通过对该位点进行单位点分析以及联合D6S285与D6S296的相关等位基因进行单倍型关联分析，均未能发现该位点上各等位基因在2组间存在显著差异(P＞0.05)，提示该位点可能与江西地区汉族精神分裂症人群的发病因素关联性不强。我们分析这种差异可能与以下因素有关:(1)精神分裂症是多基因遗传疾病，存在显著的异质性和复杂性，从而会导致不同实验室、不同地区的研究结果存在较大差异;(2)本研究目前仅限于单个候选基因的关联性研究策略模式，而靠单个STR位点进行关联研究的统计效力较弱;(3)样本的局限性也可能影响统计检验的效力;(4)参与本次研究的精神分裂症患者的病程(急、慢性)参差不齐。因此，要确定D6S296与精神分裂症的关联关系，还需要加大样本量、明确参与研究的精神分裂症各亚型及病程、扩大采集样本的研究区域以尽可能减少疾病的地区性差异和更多的人种研究等各个方面来提供证据支持。

精神分裂症是一种高度异质性疾病，且属于多基因遗传。Maziade等［14］认为，精神分裂症的遗传特异性研究可能不单单是由一个特异的位点或者基因所决定的，而可能是由许多相关易感基因的特殊结合共同作用的。因此，就本研究结果而言，虽然发现D6S285的一些等位基因频率有显著差异，显示可能存在着精神分裂症的易感基因，但尚不能就此认定这些易感基因就是致病基因，且这种基因多态性也只是一个包含多种因素相互作用进而产生最终表型的复杂网络的某一组成部分。因此，扩大样本含量、增加多态位点的分析和提高相邻基因的协同分析，并从基因表达及脑功能活动水平的层面来进一步探索微卫星DNA与精神分裂症的关联将显得极为重要。

随着全基因组关联分析等新的研究手段的日渐成熟，未来会发现更多的候选基因，但距我们真正在分子遗传学水平上揭密精神分裂症的愿望还相差甚远。如何在众多候选基因中去芜存菁?如何鉴别基因之间、基因与蛋白质之间以及基因与环境之间的复杂关系?这些都是研究者们今后需要面临的更大挑战。

［1］陈刚，温晓燕，朱海宁，等.山东省潍坊东部地区精神分裂症1号染色体基因扫描研究［J］.中华医学遗传学杂志，2007，24(3):288-292.

［2］周苇，万红娇，杨翠萍.精神分裂症相关基因的研究进展［J］.实用临床医学，2010，11(4):128-130.

［3］金禹权，玄希春，郭济兴，等.精神分裂症患者头发中锌、铜、铬的含量［J］.中国病理生理杂志，1989，5(1): 37，45.

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［9］章洁，袁也丰，万福生，等.微卫星D6S289、D6S1610多态性与精神分裂症关系［J］.中国公共卫生，2012，28 (7):939-942.

［10］张咸宁，江三多，乐燕萍，等.精神分裂症患者染色体D6S296等微卫星标志的多态性分析［J］.中华医学杂志，2002，82(5):334-337.

［11］陈建芳，王伟勇，王世恒，等.同胞精神分裂症患者与染色体D6S274和D6S296位点的关联分析［J］.中华精神科杂志，2005，38(2):73-76.

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［14］Maziade M，Roy MA，Chagnon YC，et al.Shared and specific susceptibility loci for schizophrenia and bipolar disorder:a dense genome scan in Eastern Quebec families［J］.Mol Psychiatry，2005，10(5):486-499.

Association between polymorphisms of short tandem repeats D6S285/ D6S296 and schizophrenia among the Han nationality in Jiangxi area

YU Bo1，LI Yue2，ZHU Chun-chao1，YANG Xiao-hong1，ZHANG Jie1，YUAN Ye-feng3，LUO Da-ya1，XU Fang-yun1
(1School of Basic Medical Sciences，2School of Public Health，3Department of Psychiatry，The First Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail:luodaya@hotmail.com;scbxu999@sina.com)

AIM:To analyze the association between the genetic polymorphisms of short tandem repeat(STR) sequences of D6S285/D6S296 and schizophrenia.METHODS:Schizophrenia patients of Han nationality in Jiangxi province(n=100)were selected as case group，and 100 normal people served as control group.DNA was extracted from the blood samples and the allelic frequency distribution of STR loci D6S285 and D6S296 was detected by capillary electrophoresis and analyzed by comprehensive genetic methods.RESULTS:The distribution of the alleles in D6S285 and D6S296 in control group was confirmed to match the Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05).The detection rate of D6S285-206 alleles in case group was 6.60%，which was obviously less than that in control group(13.70%，P＜0.05)，and the relative risk OR was 0.448(OR＜1).The detection rate of D6S285-212 alleles in case group was 82.70%，which was obviously higher than that in control group(73.20%，P＜0.05)，and the OR was 1.748(OR＞1).Eighteen alleles were detected at the D6S296 locus，but no statistically significant difference was found between the 2 groups(P＞0.05).CONCLUSION:The results indicate that minor genes associated with schizophrenia may exist at the D6S285 locus on the short arm of human chromosome 6.

Schizophrenia;Short tandem repeats;Genetic polymorphisms

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.013

1000-4718(2014)02-0268-06

2013-08-09

2014-01-01

国家自然科学基金资助项目(No.30860319;No.81160248)

△通讯作者罗达亚Tel:0791-86360581;E-mail:luodaya@hotmail.com;徐方云Tel:0791-88531697;E-mail:scbxu999@sina.com