MR-1通过抑制PERK/Nrf2途径减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡*

陶天琪，王晓礽，徐菲菲，刘蜜，李玉珍，刘秀华

(中国人民解放军总医院病理生理研究室，北京 100853)

·论著·

MR-1通过抑制PERK/Nrf2途径减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡*

陶天琪，王晓礽，徐菲菲，刘蜜，李玉珍，刘秀华△

(中国人民解放军总医院病理生理研究室，北京 100853)

目的:研究肌原纤维形成调节因子1(MR-1)是否通过抑制蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)途径减轻缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡。方法：在原代培养的乳大鼠心肌细胞H/R模型上，采用Annexin V/PI双标法检测心肌细胞的凋亡率;以Western blotting检测葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)、磷酸化PERK、Nrf2、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2和Bax的蛋白水平，研究过表达或敲低对于H/R致心肌细胞凋亡的影响及其与PERK/Nrf2途径活化的关系。结果:H/R引起心肌细胞凋亡;过表达MR-1减轻H/R引起的细胞凋亡(P＜0.01)，下调CHOP表达(P＜0.05)，引起Bcl-2/Bax值升高(P＜0.01)，并抑制H/R诱导的PERK磷酸化、Nrf2核转位和ATF4表达(P＜0.01)。敲低MR-1加重H/R引起的细胞凋亡(P＜0.01)、CHOP表达上调(P＜0.05)和Bcl-2/Bax值下降(P＜0.01)，并加重H/R诱导的PERK磷酸化(P＜0.05)、Nrf2核转位和ATF4表达(P＜0.01)。结论:MR-1通过抑制PERK/Nrf2途径而减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡。

细胞凋亡;缺氧/复氧;心肌细胞;肌原纤维形成调节因子1;蛋白激酶R样内质激酶;核因子E2相关因子2

缺血性疾病是严重危害人类健康的常见病［6］，尽早恢复组织血供是防治缺血损伤最有效的措施。但缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤所致的心肌细胞凋亡、坏死、恶性心律失常和心功能障碍严重影响再灌注疗法疗效和患者预后，是心血管领域亟待解决的重大问题。其中再灌注损伤诱导的心肌细胞凋亡是造成心肌梗死面积扩展、心功能障碍的重要因素，阐明调控心肌细胞凋亡的机制将为缺血再灌注的防治提供新靶点［1］。肌原纤维形成调节因子1(myofibrillogenesis regulator 1，MR-1)是课题组从人类骨骼肌cDNA文库克隆出的人类新功能基因(AF417001)，定位于人类染色体2q35，mRNA全长755 bp，编码一段142个氨基酸组成的蛋白质，在心肌、骨骼肌、肾脏和肝脏中高表达［2-4］。课题组前期工作证实，MR-1定位于心肌细胞浆的肌原纤维，缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)时心肌细胞MR-1表达下调;过表达MR-1明显减轻H/R导致的肾小管上皮细胞凋亡，提示MR-1具有抗细胞凋亡的作用，其机制尚待阐明。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是细胞应激的最初反应，可以整合并启动线粒体和细胞核反应，过度内质网应激诱导细胞凋亡主要通过蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介导的C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)途径、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)介导的caspase-12［5］和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)［6］途径所介导。其中PERK通过激活真核细胞起始因子2(eukaryotic initiator factor 2α，eIF2α)上调活化转录因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，增加CHOP的表达，导致抑凋亡因子Bcl-2蛋白下调和促凋亡因子Bax蛋白上调，引起细胞凋亡［7］。我们既往的工作证实H/R诱导心肌细胞发生严重的ERS反应，表现为内质网应激分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和PERK表达上调，ERS相关细胞凋亡分子CHOP及其下游分子Bcl-2表达下调，Bax表达上调［8-9］，提示PERK途径是介导H/R诱导心肌细胞凋亡的重要信号途径。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)在生理状态下位于细胞浆内的细胞骨架。既往研究证实I/R诱导Nrf2胞核转位，与抗氧化反应元件(antioxidant response elements，AREs)相关靶基因的启动子结合，促使抗氧化蛋白及酶类如NAD(P)H的基因转录增加，减轻氧化反应［10］。最近发现，Nrf2还是PERK的下游底物［6］，I/R诱导核转位的Nrf2在细胞核内大量聚集［10］，通过作用于ATF4启动子，上调ATF4的转录水平［11］，从而正反馈调节PERK途径凋亡相关分子ATF4，提示PERK介导的Nrf2/ATF4相关信号途径可能是I/R诱导细胞凋亡的重要机制。本工作以体外培养的乳大鼠心肌细胞缺氧8 h/复氧16 h模型模拟在体心肌I/R诱导心肌细胞凋亡，分别以腺病毒感染过表达和稳定型小干扰RNA(stealth siRNA，st-RNA)转染技术敲低MR-1表达，研究其对H/ R诱导的心肌细胞凋亡和PERK介导的Nrf2/ATF4信号途径的影响，旨在证实MR-1通过抑制PERK介导的Nrf2/ATF4相关信号途径减轻H/R导致的心肌细胞细胞凋亡，为心肌I/R的防治提供新途径。

材料和方法

1 动物与试剂

清洁级SD乳鼠(出生24 h内)购自北京市军事医学科学院实验动物中心;DMEM培养基购自Gibco;新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所;胰蛋白酶、蛋白酶抑制剂和Triton X-100购自Sigma;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit)购自南京凯基生物工程公司;蛋白电泳分子量(7～175 kD)标记为Bio-Rad产品;蛋白定量试剂盒购自康威世纪公司;脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen;兔抗人GRP78、PERK、Bcl-2、Bax多克隆抗体、兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)单克隆抗体和小鼠抗人CHOP单克隆抗体购自Cell Signaling Technology;兔抗人磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4和Nrf2多克隆抗体，Texas red-conjugated驴抗兔抗体，增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购自Santa Cruz;辣根过氧化酶标记山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG购自Epitomics;胞浆胞核蛋白分离提取试剂盒购自Thermo Fisher Scientific;含DAPI的抗淬灭封片剂购自Vector Laboratories;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)购自Merck;其余化学试剂为国产分析纯产品。

2 乳鼠心肌细胞培养与分组

按我们报道的方法［12］培养乳鼠心肌细胞:出生24 h内乳大鼠常规消毒后无菌操作取出心尖部组织，立即在4℃无菌磷酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS)中洗去残血，分离附着组织后，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小碎块，经0.15%胰蛋白酶37℃反复消化，制备心肌细胞悬液，用含10%新生牛血清的DMEM培养基稀释成细胞密度为3×109/L，接种于75 mm2培养瓶中，置37℃、5% CO2孵箱中进行原代培养。实验前24 h更换无血清DMEM培养基，进行同步化处理后，随机分为以下7 组:(1)正常对照组(control):正常连续培养48 h; (2)缺氧/复氧组(H/R):心肌细胞置于三气培养箱缺氧8 h(37℃，O2含量5%，N2含量90%，CO2含量5%)，后置于37℃、5%CO2培养箱复氧培养16 h结束实验;(3)MR-1过表达组(Ad-MR-1):以构建的MR-1重组腺病毒Ad-MR-1感染细胞，使感染复数(multiplicity of infection，MOI;即:加入病毒总数/细胞总数)为50 pfu，感染48 h后结束实验;(4) MR-1敲低组(st-MR-1):针对rat MR-1(NM_ 001134753.1)设计并筛选出25 bp的st-RNA，以50 nmol/L转染细胞，转染方法见下述，转染5 h后更换有血清DMEM培养液;(5)MR-1过表达+缺氧/复氧组(Ad-MR-1+H/R):按照(3)组方法以Ad-MR-1感染细胞20 h后更换无血清DMEM，再按照(2)组程序操作;(6)MR-1敲低+缺氧/复氧组(st-MR-1 +H/R):按照(4)组方法转染st-MR-1，转染后20 h更换无血清DMEM，再按照(2)组程序操作;(7)随机25 bp双链RNA转染对照组(mock):随机合成25 bp且GC含量与st-MR-1一致的双链st-RNA，按照(4)组方法转染操作。

3 腺病毒的包装与感染

按照文献报道方法从质粒pcDNA3.1-hMR-1［13］中扩增目的基因MR-1，委托Invitrogen公司构建包装含有MR-1全长的重组腺病毒Ad-MR-1，结果测定病毒滴度为3.3×1012pfu/L。以该病毒原液感染生长至对数期的细胞，感染前更换有血清的DMEM培养液，每1×105个细胞约加入病毒液10 μL，使感染复数约为50 pfu，感染48 h后结束实验。

4 st-RNA的构建与转染

针对rat MR-1(NM_001134753.1)设计并筛选出25bp的st-RNA(st-MR-1)，序列为5’-CGACAGCUAACAAGGCUUCCCAGAA-3’，以50 nmol/L转染细胞，转染方法参照Lipofectamin 2000试剂盒说明书进行，转染5 h后更换有血清DMEM培养液15 h后更换无血清DMEM培养液。

5 Annexin V/PI双标法检测细胞凋亡

培养的乳大鼠心肌细胞以1×104/cm2的密度接种于25 mm2培养皿，参照Annexin V-FITC Apoptosis Direction Kit说明书的方法进行检测:实验处理结束后以含EDTA的0.25%胰酶消化并收集细胞，以0.01 mol/L PBS离心洗涤细胞2次(3 000 r/min离心30 s)，洗涤后的沉淀以500 μL Binding Buffer悬浮均匀，分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混合均匀，室温下避光孵育10 min后，流式细胞术检测早期凋亡率和晚期凋亡率之和。

6 Nrf2细胞荧光染色

细胞以1×104/cm2的密度接种于包被有明胶的盖玻片，实验处理后以PBS洗涤3次，-20℃预冷的冰甲醇预固定5 min，4%多聚甲醛固定15 min，以含有0.1%Triton X-100、含1%BSA的PBS在室温下封闭50 min，以1%BSA配制Ⅰ抗工作液:多克隆兔抗人Nrf2(1∶40)，室温下Ⅰ抗工作液孵育1 h，PBS洗涤10 min×3次，以PBS配制Ⅱ抗工作液: Texas red-conjugated驴抗兔(1∶200)。Ⅱ抗工作液于室温下避光孵育1 h，以PBS洗涤10 min×3次，用含DAPI的抗淬灭封片剂封片，激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM-510 Meta)观察并采集图像。

7 Nrf2胞浆胞核蛋白分离与蛋白定量

按照胞浆胞核蛋白分离提取试剂盒的操作步骤进行，以BCA法进行蛋白定量。

8 免疫印迹法

取含有80 μg蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后以半干式法电转至硝酸纤维素膜上，0.01mol/L TBST(20 mmol/L Tris-HCl，137 mmol/L NaCl，0.01%Tween-20，pH 7.5)配制的5%BSA室温封闭，加入Ⅰ抗于4℃过夜杂交，不同抗体的稀释度分别为:anti Bcl-2(1∶1 000)，anti Bax(1∶1 000)，anti CHOP(1∶500)，anti ATF4(1∶200)，anti Nrf2 (1∶100)，antip-PERK(1∶500)，antiPERK (1∶1 000)，anti GRP78(1∶500)，anti GAPDH (1∶1 000);加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗(TBST配制，1∶1 000)，室温作用2 h后以ECL试剂盒发光显影。以图像分析软件Image-Pro Plus测量各组条带积分吸光度(integrated absorbance，IA;IA=mean absorbance×area)进行半定量分析，并与内参照GAPDH的IA值进行比较。

9 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件分析，数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)进行组间比较，采用q检验进行两两比较;对胞核Nrf2蛋白量与ATF4蛋白量进行相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 MR-1减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡

流式细胞术检测细胞凋亡率的结果见图1。缺氧8 h/复氧16 h(H/R组)心肌细胞凋亡率较正常对照组高［(12.1±2.2)%vs(6.3±1.1)%，P＜0.01］。与正常对照组比较，重组腺病毒Ad-MR-1感染心肌细胞48 h致MR-1过表达的Ad-MR-1组细胞凋亡率无明显改变(P＞0.05);但MR-1过表达明显抑制心肌细胞H/R诱导的心肌细胞凋亡增加［(9.1 ±1.5)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。以st-RNA敲低MR-1表达后诱导心肌细胞凋亡［(15.9± 2.1)%vs(12.0±1.1)%，P＜0.01］;与单纯H/R组比较，MR-1敲低加重H/R诱导的心肌细胞凋亡［(17.2±0.8)%vs(12.1±2.2)%，P＜0.01］。上述结果提示MR-1具有抑制H/R诱导心肌细胞凋亡的作用。

Figure 1.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation(H/R)in vitro as determined by flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide(PI)double-stained cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图1 Annexin V/PI双染的流式细胞术分析MR-1对H/R诱导心肌细胞凋亡的影响

2 MR-1减轻H/R诱导的内质网应激及其相关细胞凋亡

Western blotting检测心肌细胞内质网应激相关分子GRP78的结果见图2。与正常对照组比较，H/ R组GRP78蛋白表达高1.1倍(P＜0.01)，提示H/R可诱导心肌细胞产生内质网应激。Ad-MR-1组GRP78蛋白表达较正常对照组高1倍(P＜0.01)，与H/R组无显著差异(P＞0.05)，但是MR-1过表达减轻了H/R诱导的内质网应激分子GRP78蛋白表达，表现为Ad-MR-1+H/R组GRP78蛋白表达较H/R组低14.2%(P＜0.01)，提示单纯过表达MR-1可产生内质网应激反应，而MR-1过表达减轻了H/R诱导的内质网应激反应。Mock组GRP78蛋白表达较正常对照组高61.7%(P＜0.01)，而敲低MR-1(st-MR-1 组)GRP78蛋白表达较Mock组高21.2%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌细胞在H/R后(st-MR-1+H/R组) GRP78蛋白表达较H/R组高5.6%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以诱导内质网应激反应，并进一步加重H/R诱导的内质网应激反应。

Figure 2.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the expression of GRP78 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图2 MR-1对H/R心肌细胞GRP78蛋白表达的影响

内质网应激相关细胞凋亡分子CHOP表达的检测结果见图3。与正常对照组比较，H/R组CHOP蛋白表达高16.0%(P＜0.01)，提示H/R可诱导内质网应激相关细胞凋亡;单纯过表达MR-1对CHOP蛋白表达无明显影响(P＞0.05)，但是过表达MR-1却减少H/R诱导的CHOP蛋白表达，表现为CHOP蛋白表达较H/R组低9.9%(P＜0.05)，提示MR-1过表达明显抑制H/R诱导的内质网应激相关细胞凋亡。Mock组心肌细胞CHOP蛋白表达较正常对照组高14.2%(P＜0.01);与mock组比较，st-MR-1组心肌细胞CHOP蛋白表达高8.6%(P＜0.01);敲低MR-1的心肌细胞行H/R后CHOP蛋白表达较H/R组高5.1%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以诱导内质网应激相关的细胞凋亡，并进一步加重H/R诱导的内质网应激相关的细胞凋亡。

Figure 3.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ERS-related apoptotic protein CHOP in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图3 MR-1对H/R心肌细胞CHOP蛋白表达的影响

进一步分析CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达的结果见图4。与正常对照组比较，H/R组抑凋亡因子Bcl-2蛋白表达低20.6%，促凋亡因子Bax蛋白表达高18.9%，Bcl-2/ Bax值低33.2%(P＜0.01)，提示H/R诱导心肌细胞内质网应激相关细胞凋亡的CHOP途径活化。单纯过表达MR-1的Ad-MR-1组Bcl-2和Bax蛋白表达无显著差异(P＞0.05)，但却明显影响H/R诱导的CHOP下游促凋亡因子Bax蛋白和抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达。与H/R组比较，Ad-MR-1+H/R组Bcl-2蛋白表达高29.3%，Bax蛋白表达低15.9%，Bcl-2/Bax值高53.7%(P＜0.01)，提示MR-1过表达可以减轻H/R诱导的CHOP凋亡途径活化。与正常对照组比较，mock组Bcl-2和Bax蛋白表达分别高23.4%和20.8%，Bcl-2/Bax值低15.2%(P＜0.01)，st-MR-1组Bcl-2和Bax蛋白表达较mock组分别低41.0%和18.8%(P＜0.05)，但Bcl-2/Bax值低27.3%(P＜0.01);敲低MR-1进一步加重H/ R诱导的Bcl-2下调和Bax上调，表现为与H/R组比较，st-MR-1+H/R组心肌细胞Bcl-2蛋白表达降低25.4%，Bax蛋白表达增高26.2%，Bcl-2/Bax值降低28.8%(P＜0.01)，提示敲低MR-1本身可以诱导CHOP凋亡途径活化，并进一步加重H/R诱导的CHOP凋亡途径活化。

Figure 4.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 and proapoptotic protein Bax，and Bcl-2/Bax ratio in H/R-induced cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图4 MR-1对H/R心肌细胞Bcl-2和Bax蛋白表达及Bcl-2/Bax值的影响

3 MR-1通过PERK/Nrf2途径减轻内质网应激相关细胞凋亡

3.1 MR-1抑制H/R诱导的PERK磷酸化Western blotting检测心肌细胞PERK表达与磷酸化的结果见图5。H/R明显上调PERK表达及其磷酸化，其PERK蛋白表达和磷酸化水平分别较正常对照组高24.6%和100%(P＜0.01)，提示H/R上调PERK蛋白表达和磷酸化，其中磷酸化上调更为明显。单纯过表达MR-1的Ad-MR-1组PERK蛋白表达和磷酸化水平较正常对照组无显著差异(P＞0.05);而过表达MR-1后行H/R的心肌细胞，尽管其PERK蛋白表达较H/R组高18.5%(P＜0.05)，却明显下调PERK磷酸化水平，其PERK磷酸化水平较H/R组低56.5%(P＜0.01)，提示单纯过表达MR-1对PERK的蛋白表达和磷酸化无明显影响，但明显抑制H/R诱导的PERK磷酸化上调。与正常对照组比较，mock组PERK蛋白表达无显著差异(P＞0.05)，但其磷酸化水平高22.1%(P＜0.01);与mock组比较，单纯敲低MR-1的st-MR-1组PERK蛋白表达和磷酸化水平分别高17.7%和35.0%(P＜0.01)，而与H/R组比较，敲低MR-1的心肌细胞在H/R后其PERK蛋白表达无明显改变(P＞0.05)，但PERK磷酸化水平高2.5%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以诱导PERK磷酸化，并进一步上调H/R诱导的PERK磷酸化。

Figure 5.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the phosphorylation of PERK in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图5 MR-1对H/R心肌细胞PERK磷酸化的影响

3.2 MR-1抑制H/R诱导的Nrf2核转位采用细胞免疫荧光染色检测PERK下游分子Nrf2亚细胞分布的结果见图6A。正常对照组Nrf2蛋白主要均匀分布于胞浆，胞核内少量均匀分布。与正常对照组比较，H/R组心肌细胞内Nrf2出现明显的核转位现象，Nrf2主要集聚在细胞核内和核周，且在核内呈团块状分布;单纯过表达MR-1对Nrf2亚细胞分布无明显影响，表现为Ad-MR-1组Nrf2在心肌细胞胞浆内均匀分布，少量均匀分布在核内，与正常对照组类似;但过表达MR-1明显减轻H/R诱导的心肌细胞Nrf2核转位，表现为Ad-MR-1+H/R组心肌细胞内Nrf2均匀分布于胞浆，少量Nrf2均匀分布于核内;与正常对照组比较，mock组Nrf2在胞浆和胞核内均匀分布，但在少数细胞的核内呈团块状分布;与mock组比较，敲低MR-1后心肌细胞Nrf2集中分布在核内和核周，提示敲低MR-1可以造成Nrf2核转位，且敲低MR-1进一步加重H/R诱导的心肌细胞Nrf2核转位，表现为st-MR-1+H/R组心肌细胞内Nrf2团块状积聚于胞核内和核周，极少量分布于胞浆。上述结果表明，H/R造成Nrf2核转位，过表达MR-1明显减轻H/R诱导的Nrf2核转位，敲低MR-1加重H/R诱导的心肌细胞Nrf2核转位。

Western blotting检测Nrf2胞浆与胞核组分蛋白的结果见图6B、C。正常对照组心肌细胞胞浆和胞核中均存在Nrf2蛋白。H/R组Nrf2胞核组分蛋白较正常对照组高47.9%(P＜0.01)，胞浆组分蛋白无明显改变(P＞0.05)，提示H/R增加Nrf2蛋白的表达并诱导其核转位。单纯过表达MR-1对心肌细胞Nrf2胞核组分蛋白无明显影响(P＞0.05)，但胞浆组分蛋白较正常对照组高32.5%(P＜0.01);与H/R组比较，过表达MR-1后行H/R的心肌细胞，尽管其胞浆组分蛋白较H/R组高1.2倍，但是明显减少了H/R诱导的Nrf2胞核组分蛋白上调，其Nrf2胞核组分蛋白较H/R低30.6%(P＜0.01)，提示过表达MR-1增加Nrf2蛋白在胞浆的分布，但抑制H/R诱导的Nrf2核转位。与正常对照组比较，mock组的Nrf2胞核和胞浆组分均升高，表现为胞核组分蛋白高31.4%，胞浆组分蛋白高25.7%(P＜0.01);与mock组比较，敲低MR-1仅引起Nrf2胞核组分蛋白上调，表现为Nrf2胞核组分蛋白高18.5%(P＜0.01)，胞浆组分无显著差异(P＞0.05);敲低MR-1进一步加重H/R诱导的心肌细胞Nrf2胞核组分蛋白上调，表现为st-MR-1+H/R组心肌细胞核Nrf2蛋白较H/R组高36.1%(P＜0.01)，但对胞浆组分无明显影响(P＞0.05)，提示敲低MR-1进一步上调H/R诱导的Nrf2胞核组分蛋白，加重H/R诱导的Nrf2核转位。

3.3 MR-1抑制H/R诱导的Nrf2下游分子ATF4表达上调Western blotting检测Nrf2的下游分子ATF4表达的结果见图7。与正常对照组比较，H/R 组ATF4蛋白表达高51.6%(P＜0.01)，提示H/R可通过激活PERK途径导致心肌细胞内质网应激相关凋亡。过表达MR-1对ATF4蛋白表达无明显影响(P＞0.05)，却明显抑制H/R诱导的ATF4蛋白表达，表现为Ad-MR-1+H/R组ATF4蛋白表达较H/R组低17.7%(P＜0.01)，提示MR-1过表达通过抑制PERK途径的激活减轻H/R诱导的内质网应激相关细胞凋亡。Mock组的ATF4蛋白表达较正常对照组高19.9%(P＜0.01)，但st-MR-1组ATF4蛋白表达较mock组高42.4%(P＜0.01);敲低MR-1可加重H/R诱导的ATF4蛋白表达，表现为st-MR-1 +H/R组较H/R组高27.4%(P＜0.05)，提示敲低MR-1本身可以激活PERK途径诱导内质网应激相关细胞凋亡，并通过进一步激活PERK途径加重H/ R诱导的内质网应激相关细胞凋亡。

Figure 6.Myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)reduced the nuclear translocation of Nrf2 in H/R-treated cardiomyocytes.A:Nrf2 immunofluorescence assay and DAPI staining under laser scanning confocal microscope (×600);B，C:the levels of nuclear Nrf2 protein and cytoplasmic Nrf2 protein examined by Western blotting.GAPDH was used as a normalization control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图6 MR-1对H/R心肌细胞Nrf2蛋白核转位的影响

Figure 7.Effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on the expression of ATF4 in H/R-treated cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;＆P＜0.05 vs mock.图7 MR-1对H/R心肌细胞ATF4蛋白表达的影响

3.4 Nrf2胞核组分蛋白与ATF4蛋白表达的相关分析相关分析显示，Nrf2胞核组分蛋白与ATF4蛋白表达呈显著正相关(r=0.935，P＜0.01)。

讨论

I/R损伤指缺血一定时间的心肌恢复灌流后，组织损伤反而进行性加重，心肌细胞从可逆损伤转变为不可逆损伤的现象。心肌细胞凋亡和坏死是心肌再灌注损伤的特征之一［14］。减轻心肌细胞凋亡是减轻心肌细胞I/R损伤的关键途径。心肌细胞H/R可在一定程度上模拟心肌缺血再灌注损伤，研究证实H/R可诱导心肌细胞凋亡［8-9］。MR-1是一种从人类骨骼肌cDNA文库克隆出的新功能基因，在心肌、骨骼肌、肾脏和肝脏中高表达［2-4］。本研究首次证实了MR-1通过减轻PERK磷酸化降低H/R诱导的心肌细胞凋亡，对H/R的心肌细胞具有保护作用。

前期工作证实，过表达MR-1明显减轻H/R诱导的肾小管上皮细胞凋亡，提示MR-1可能具有抗细胞凋亡的作用。本研究在新生SD乳鼠心肌细胞H/ R模型上，采用Annexin V/PI双染结合流式细胞术的方法，证实了H/R诱导心肌细胞凋亡，表现为H/ R组细胞凋亡率较正常对照组高，与文献报道一致［15］。MR-1在心肌细胞中有生理性表达［2-4］，定位于心肌细胞浆的肌原纤维，H/R时心肌细胞MR-1表达下调。本研究证实MR-1减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡。我们以缺氧8 h/复氧16 h处理心肌细胞模拟在体的心肌I/R损伤，发现H/R诱导体外培养的心肌细胞凋亡。我们以含有MR-1全长的重组腺病毒感染心肌细胞，发现过表达MR-1对细胞凋亡率较正常对照组无明显改变，但MR-1过表达明显抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡。相反，以st-RNA转染心肌细胞以抑制MR-1的表达，发现敲低MR-1可引起心肌细胞凋亡率的升高，且敲低MR-1加重H/R诱导的心肌细胞凋亡率。

H/R所致的心肌细胞凋亡机制尚未完全阐明。近年来，ERS相关细胞凋亡在心肌细胞凋亡的发病机制中的作用越来越受到重视。ERS是细胞对内外刺激的适应性反应。适度ERS诱导GRP78等内质网伴侣分子表达上调，有利于内质网处理未折叠蛋白或错误折叠蛋白，并促进钙稳态的恢复;持续而严重的ERS可明显上调GRP78的表达，诱导ERS相关的促凋亡因子CHOP的表达及活化，触发ERS相关凋亡途径［6］。CHOP是过度ERS诱导细胞凋亡的关键分子，可直接下调Bcl-2的表达，导致Bax从胞浆转位至线粒体，促进细胞凋亡［16］。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡，Bax与Bcl-2形成异源二聚体时抑制细胞凋亡［17］。Bcl-2与Bax蛋白量的比率决定异二聚体(Bcl-2/Bax)与同二聚体(Bax/ Bax)的比值，故细胞凋亡的发生取决于Bcl-2和Bax的相对浓度，即Bcl-2/Bax值［18］。在正常培养的心肌细胞中，GRP78、CHOP、Bcl-2和Bax均有生理性表达，我们以H/R处理心肌细胞，发现H/R诱导心肌细胞产生ERS相关的细胞凋亡，GRP78、CHOP和Bax表达均高于正常对照组，Bcl-2表达和Bcl-2/Bax值则均低于正常对照组。过表达MR-1可引起适度ERS，但没有引起ERS相关细胞凋亡，表现为GRP78表达较正常对照组高，但对细胞凋亡率及凋亡相关分子的表达无明显影响;过表达MR-1明显减轻H/R诱导的ERS相关心肌细胞凋亡，表现为较H/R组GRP78、CHOP和Bax蛋白表达更低，Bcl-2蛋白表达更高，Bcl-2/Bax值更高;敲低MR-1可产生ERS相关心肌细胞凋亡，表现为较mock组GRP78和CHOP蛋白表达高，Bcl-2/Bax值低;且MR-1敲低后H/R较单纯H/R诱导的ERS相关细胞凋亡更为严重，表现为较H/R组GRP78、CHOP和Bax蛋白表达更高，Bcl-2蛋白表达更低，Bcl-2/Bax比值更低。上述结果提示，MR-1可能作为一个重要的内源性保护分子，在减轻H/R诱导的心肌细胞ERS相关凋亡中发挥重要作用。

PERK是介导ERS相关细胞凋亡的重要感受分子。生理状态下，PERK与内质网相关分子GRP78结合，以无活性复合物的形式存在［19］。未折叠蛋白增多时，GRP78与未折叠蛋白结合而与PERK解离。解离后的PERK发生自身磷酸化而被激活，进一步磷酸化其下游底物eIF2α，选择性上调ATF4。长期过度内质网应激时，ATF4上调CHOP的转录，导致ERS相关细胞凋亡［20］。我们前期研究结果显示，与正常对照组比较，H/R诱导的PERK磷酸化水平、PERK下游信号分子ATF4和CHOP的表达更高，提示H/R诱导PERK介导的ERS相关细胞凋亡［8-9］。Nrf2生理状态时位于细胞浆内的细胞骨架，与其抑制蛋白Keap1结合，处于非游离、非活性状态。当I/ R诱导Nrf2发生核转位，作用于AREs的相关序列，激活相关靶基因，继而启动下游抗氧化蛋白及酶类的基因转录，提高细胞抗氧化应激能力［10］。近期研究证实Nrf2是位于PERK下游的重要转录因子，PERK磷酸化激活Nrf2发生核转位［6］，Nrf2的胞核组分蛋白可能作用于ATF4启动子，上调ATF4的转录水平［11］，并进一步上调CHOP的转录，导致ERS相关细胞凋亡［20］。根据文献报道，将人视网膜色素上皮细胞敲低Nrf2后行缺氧处理，ATF4的表达较缺氧组明显降低。染色质免疫共沉淀结果显示Nrf2作用于ATF4启动子，且过表达Nrf2激活ATF4启动子，促进ATF4的转录［11］。此外，敲低内皮细胞的Nrf2后行氧化磷脂处理，亦可显著降低ATF4表达［21］。根据文献推断，细胞凋亡可通过内外因素激活PERK/Nrf2核转位/ATF4/CHOP途径发生。

本研究证实，在正常培养的心肌细胞中，Nrf2存在于胞核和胞浆内，但以胞浆内分布为主，PERK、ATF4和CHOP均有生理性表达。我们以H/R处理心肌细胞，发现H/R诱导心肌细胞PERK磷酸化，引起Nrf2核转位，上调ATF4的表达，进而上调CHOP的表达。同时，虽然过表达MR-1对PERK途径无明显影响，表现为PERK磷酸化及下游信号分子的蛋白表达无明显变化，但是过表达MR-1后行H/R处理，可下调H/R诱导的心肌细胞PERK磷酸化，减少Nrf2核转位，下调ATF4和CHOP的蛋白表达，提示过表达MR-1可通过减轻H/R对PERK途径的激活，减轻H/R诱导的ERS相关细胞凋亡。此外，敲低MR-1可诱导PERK磷酸化介导的ERS相关细胞凋亡，表现为PERK磷酸化高于MOCK组，Nrf2核转位较mock组更明显，ATF4和CHOP蛋白表达较mock组高;敲低MR-1后行H/R处理可通过进一步激活H/R诱导的PERK途径，进而加重H/R诱导的ERS相关细胞凋亡，表现为PERK磷酸化较H/R组高，Nrf2核转位较H/R组更明显，ATF4和CHOP蛋白表达较H/R组高。在此基础上对ATF4蛋白表达和胞核Nrf2蛋白之间进行相关分析发现，ATF4蛋白表达与Nrf2胞核组分蛋白呈正相关，提示Nrf2核转位介导的凋亡信号途径可能通过促进ATF4蛋白表达引起细胞凋亡。

另有文献报道，转录因子Nrf2和ATF4具有相似的靶基因，存在协同和拮抗作用。两者可直接诱导AREs相关基因的转录［22］，但也可直接作用于CHOP启动子，ATF4促进CHOP转录，Nrf2抑制CHOP转录［23］。此外，Nrf2也可通过解除ATF4与CHOP的结合，进而抑制CHOP转录［24］。根据研究结果推断，我们认为在H/R引起心肌细胞PERK介导的ERS相关细胞凋亡的过程中，Nrf2发生核转位，促进ATF4的表达。虽然Nrf2可直接或间接下调CHOP的转录，但是ATF4上调促进CHOP的表达增加起主要作用。这提示H/R通过PERK介导的Nrf2核转位/ATF4/CHOP途径诱导心肌细胞凋亡，而MR-1通过抑制上述途径减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡。

综上所述，我们认为MR-1通过抑制过度ERS发挥减轻心肌H/R损伤的作用，表现为降低H/R诱导的GRP78蛋白表达，抑制PERK介导的Nrf2核转位/ATF4/CHOP途径，减轻H/R诱导的ERS相关细胞凋亡。但MR-1对在体大鼠心肌I/R损伤的心肌保护作用尚待进一步研究。

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Myofibrillogenesis regulator 1 attenuates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis of cardiomyocytes by inhibiting PERK/Nrf2 pathway

TAO Tian-qi，WANG Xiao-reng，XU Fei-fei，LIU Mi，LI Yu-zhen，LIU Xiu-hua
(Department of Pathophysiology，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China.E-mail:xiuhualiu98@163.com)

AIM:To investigate the effect of myofibrillogenesis regulator 1(MR-1)on hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced apoptosis of cardiomyocytes and to study the role of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK)/nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)pathway.METHODS:In the H/R model of primarily cultured neonatal rat cardiomyocytes，the apoptosis was assessed by Annexin V/PI double staining.Western blotting was used to detect the protein levels of glucose-regulated protein 78(GRP78)，phosphorylated PERK，Nrf2，activating transcription factor 4 (ATF4)，C/EBP homologous protein(CHOP)，Bcl-2 and Bax.The effects of over-expression or knockdown of MR-1 on the apoptosis and the PERK/Nrf2 pathway were determined.RESULTS:H/R induced the apoptosis of cardiomyocytes.Compared with H/R group，MR-1 over-expression attenuated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，down-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and increased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 over-expression suppressed H/R-induced PERK phosphorylation，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).However，MR-1 knockdown aggravated H/R-induced apoptosis(P＜0.01)，up-regulated CHOP expression(P＜0.05)，and decreased Bcl-2/Bax ratio(P＜0.01).MR-1 knockdown up-regulated H/R-induced PERK phosphorylation(P＜0.05)，Nrf2 nuclear translocation and ATF4 expression(P＜0.01).CONCLUSION:MR-1 suppresses H/R-induced cardiomyocyte apoptosis by inhibiting PERK/Nrf2 pathway.

Apoptosis;Hypoxia/reoxygenation;Cardiomyocytes;Myofibrillogenesis regulator 1;Protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;Nuclear factor E2-related factor 2

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.001

1000-4718(2014)02-0193-10

2013-10-15

2014-01-02

国家自然科学基金资助项目(No.81170140;No.81070130)

△通讯作者Tel:010-66939763;E-mail:xiuhualiu98@163.com