西洛他唑自微乳化释药系统大鼠体内药动学

邱妍川,林凤云,张亚红,马俐丽,杨建英,朱照静

(1.重庆医药高等专科学校,重庆 401331;2.重庆市铜梁县巴川镇中心卫生院,铜梁 402560)

西洛他唑自微乳化释药系统大鼠体内药动学

邱妍川1,林凤云1,张亚红1,马俐丽1,杨建英2,朱照静1

(1.重庆医药高等专科学校,重庆 401331;2.重庆市铜梁县巴川镇中心卫生院,铜梁 402560)

目的 建立测定大鼠血浆西洛他唑浓度的方法,考察西洛他唑自微乳化释药系统在大鼠体内的药动学。方法利用高效液相色谱法:色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈∶水=45∶55,检测波长285 nm,流速1.0 mL·min-1,测定大鼠灌胃西洛他唑混悬剂与自微乳化制剂后的血药浓度,并采用3P97药动学软件处理数据。结果在10～500 ng·mL-1范围内,血浆西洛他唑浓度呈线性关系,r=0.999 6,日内、日间精密度RSD均＜6.33%;大鼠灌胃给药后,西洛他唑自微乳化制剂Cmax为(278.53±40.48)ng·mL-1,tmax为(2.81±0.44)h, AUC(0～48)为(4 205.61±297.59)mg·mL-1·h;西洛他唑混悬剂Cmax为(181.22±12.77)ng·mL-1,tmax为(3.62± 0.51)h,AUC(0～48)为(2 173.08±242.35)mg·mL-1·h,经SPSS10.0版统计软件分析,均差异有统计学意义(P＜0.01),自微乳化制剂相对混悬剂的生物利用度为194%。结论西洛他唑自微乳化释药系统可显著提高口服生物利用度。该方法专属性强,灵敏度高,准确性好,适合大鼠血浆中西洛他唑自微乳化制剂的药动学研究。

西洛他唑;自微乳化释药系统;药动学

目前西洛他唑(cilostazol,CLT)上市的剂型主要为片剂与胶囊剂,均为普通口服制剂[1]。自微乳化释药系统(self-microemulsifyingdrugdeliverysystem, SMEDDS)由油相、非离子表面活性剂和助乳化剂形成的热力学稳定、均一澄明的液体水包油。其乳滴具有巨大的比表面积,可提高水难溶性药物的溶出,促进药物在胃肠道的吸收及淋巴转运[2]。因此将CLT制成SMEDDS,即CLT-SMEDDS,有望改善其吸收现状。笔者在本实验中建立CLT-SMEDDS大鼠血浆中药物浓度的测定方法,通过研究体内药动学,探讨SMEDDS提高CLT口服制剂吸收的可行性。

1 材料与方法

1.1 动物 选取健康合格斯波累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠12只,雌雄各半,体质量(250±30)g,由重庆医科大学动物实验中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(渝)2007-0001,实验动物使用许可证号:SYXK(渝)2007-0001。

1.2 试药及其制备 CLT工作对照品及原料(重庆康乐制药有限公司,纯度:99.5%,批号:120604),地西泮原料(西安万昌生物科技有限公司,批号:120318,纯度:99.6%),肉豆蔻酸异丙酯(isopropyl myristate, IPM,美国Fluka公司,批号:1216171,21106124),聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL,美国Fluka公司,批号: 1210306,44506130),聚乙二醇-8-甘油辛酸/癸酸酯(labrasol,法国Gattefosse公司,批号:33347)。乙腈(重庆川东化工有限公司,色谱纯),甲醇(重庆川东化工有限公司,色谱纯),其余试剂均为分析纯,水为纯化水。

自制CLT-SMEDDS:称取油相肉豆蔻酸异丙酯2.84 g,表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油4.31 g,助乳化剂聚乙二醇-8-甘油辛酸/癸酸酯1.54 g,37℃水浴, 50 r·min-1搅拌10 min,加入CLT1.53 g,同样条件下搅拌20 min,即得CLT-SMEDDS[3]。

自制CLT混悬液:称取CLT1.53 g,加0.5%羧甲基纤维素钠溶液10 mL,研磨成CLT混悬液。

1.3 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪系统:由G1315B二极管阵列检测器,G1313A全自动进样器, Agilent1100高效液相色谱化学工作站组成(美国Agilent公司);BOND ODS-C18固相萃取柱(200 mg, 3 mL,美国Agilent公司);QL-901旋涡混匀器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);MF1-A10超纯水器(默克密理博公司);TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂);Sartorius BS210S电子天平(德国Sartorius公司); BF2000氮气吹干仪(北京八方世纪科技有限公司)。

1.4 色谱条件 色谱柱:Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈∶水=45∶55;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:285 nm;柱温: 25℃;进样量:20 μL。

1.5 内标溶液的配制 取地西泮适量精密称定,置于100 mL量瓶,加甲醇溶解并定容,制成10 μg·mL-1内标储备液。精密量取内标储备液5.0 mL于100 mL量瓶,加流动相配成500 ng·mL-1内标溶液。

1.6 标准溶液的配制 取CLT对照品适量,精密称定,置于量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,制成5 μg·mL-1CLT储备液。精密量取CLT储备液5.0 mL于50 mL量瓶中,加流动相配成500 ng·mL-1的CLT标准溶液。

1.7 血浆样品的处理

1.7.1 固相萃取小柱的处理 甲醇和纯化水各6 mL活化,再用0.1 mol·L-1磷酸氢二钠溶液3 mL平衡。

1.7.2 血液样品的处理 精密吸取大鼠血浆0.25 mL,内标储备液10 μL,0.1 mol·L-1磷酸氢二钠溶液100 μL,乙腈0.6 mL,涡旋振荡30 s,离心10 min (15 000×g),将上清液转入10 mL试管中,加入0.01 mol·L-1磷酸氢二钠溶液5 mL混匀,置已预活化过的固相萃取小柱,常压下使样品通过固相萃取小柱,再用纯化水15 mL冲洗,抽干,用甲醇1 mL洗脱,收集洗脱液,将洗脱液水浴40℃氮气(N2)吹干。残渣用流动相0.2 mL复溶,取20 μL供高效液相色谱(HPLC)分析。

1.8 色谱条件专属性考察 采用“1.4”项色谱条件,分别考察标准溶液中CLT、内标溶液中地西泮及空白血浆的出峰时间。

1.9 血浆中CLT标准曲线的建立 精密吸取空白血浆0.25 mL,再精密加入CLT储备液适量,按“1.7.2”项处理,制成含CLT浓度分别为10(低),25,50,100 (中),300,500(高)ng·mL-1线性标准溶液,高中低浓度各重复操作2管,取线性标准溶液20 μL进样,测定样品,记录药物及内标的峰面积,计算其峰面积比值(CLT/内标,R),以R对血浆浓度(C)进行线性回归分析。

1.10 定量限与最低检测限 分别以空白血浆定量稀释某一浓度CLT线性溶液,按照“1.9”项操作,当信噪比约为10∶1时,连续进样6次,若RSD≤10%,此浓度即为定量限;当信噪比为3∶1时,此时的浓度即为最低检测限。

1.11 回收率实验

1.11.1 相对回收率 分别配制含低、中、高浓度(10,100,500 ng·mL-1)CLT血浆样品各5份,按“1.7.2”项处理,进样20 μL作HPLC分析,将所得峰面积比代入回归方程算得浓度,与标示浓度相比,即得相对回收率。

1.11.2 绝对回收率 分别配制低、中、高浓度含CLT血浆样品各5份,按“1.7.2”项处理,进样20 μL作HPLC分析,另用“1.7.2”项处理所得的空白血浆配制相应浓度CLT对照品溶液,直接进样,记录峰面积,将所得峰面积相比,即得绝对回收率。

1.12 精密度实验

1.12.1 日内精密度 分别配制低、中、高浓度含CLT血浆样品各5份,按“1.7.2”项处理,进样20 μL作HPLC分析,记录峰面积比,按回归方程计算样品浓度,计算日内精密度。

1.12.2 日间精密度 分别连续5 d配制低、中、高浓度含CLT血浆样品各5份,按“1.7.2”项处理,进样20 μL作HPLC分析,计算日间精密度。

1.13 样品稳定性实验

1.13.1 日内稳定性 分别配制低、中、高浓度含CLT血浆样品各1份,按“1.7.2”项处理,常温保存,在当天0,2,4,8,16,24 h分别进样,计算日内稳定性。

1.13.2 冰冻稳定性 分别配制低、中、高浓度含CLT血浆样品各6份,置于-20℃冰箱保存,分别在1,2, 4,8,16,24 d各取出一份,按“1.7.2”项处理进样,计算冰冻稳定性。

1.13.3 冻融稳定性 分别按“1.7.2”项处理并配制低、中、高浓度的含CLT血浆样品各5份,冻融3次后测定,计算回收率及RSD,考察其冻融稳定性。

1.14 药动学

1.14.1 给药方案与血样采集 将12只SD大鼠随机分成2组,每组6只,实验前禁食12 h,自由饮水。按30 mg·kg-1剂量灌胃,按组分别依次给予CLTSMEDDS、CLT混悬液。分别于给药后0.5,1,1.5,2, 3,4,6,8,12,24,36,48 h经眼眶取血0.5 mL,肝素抗凝,4 000 r·min-1离心10 min(半径6 cm),分离血浆, -20℃冷冻保存供分析用。

1.14.2 血浆中药物浓度数据处理与计算 用3P97实用药动学计算程序(中国药理学会数学药理专业委员会编制),处理血药浓度数据,计算药动学参数,并用SPSS10.0版统计软件进行统计分析。

2 结果

2.1 方法可行性考察 在本实验色谱条件下,CLT和内标分离完全,保留时间分别约为5.5和6.3 min,峰形良好,血浆中内源性物质不干扰测定,样品中药物的保留时间与标准品一致。CLT对照品及内标、空白血浆、给药后血浆样品色谱图见图1。

图1 大鼠血浆CLT的HPLC图

2.2 血浆标准曲线 以R对C进行线性回归分析。线性回归方程为:R=0.001 8C-0.006 7,r=0.999 6。结果表明,CLT血浆浓度在10～500 ng·mL-1范围内,峰面积比值与血药浓度线性关系良好。

2.3 回收率 见表1,2。血浆中相对回收率(96.55± 5.08)%～(97.90±2.87)%,绝对回收率＞80%,RSD均＜10%,能满足方法学要求。

2.4 精密度 见表3。血浆样品日内RSD和日间RSD均在1.67%～6.33%,表明精密度满足方法学验证要求。

2.5 样品稳定性实验结果 见表4～5。血浆样品日内稳定性考察中浓度变化在97.12%～100.67%,冰冻稳定性考察中浓度变化在96.84%～100.10%,冻融稳定性考察回收率在96.70%～99.03%,符合方法学验证要求。

2.6 定量限与最低检测限 当信噪比为10时,定量限浓度为10 ng·mL-1,连续进样6针的RSD为7.90%满足≤10%的要求,当信噪比为3时,最低检测限浓度为4 ng·mL-1。

表1 血浆中CLT相对回收率实验结果 %,n=5

表2 血浆中CLT绝对回收率实验结果 %,n=5

表3 CLT在血浆中的精密度实验结果 %,n=5

表4 CLT日内稳定性实验结果

表5 CLT冰冻稳定性实验结果

2.7 药动学研究 SD大鼠给药后,测得平均血药浓度-时间曲线见图2。

以3P97软件计算,口服CLT-SMEDDS及CLT混悬液后,其药动学主要参数见表7。

表6 CLT冻融稳定性实验结果

3 讨论

血浆中CLT的HPLC检测,国内外已有报道[1,4]。本实验中,笔者先后采用直接沉淀蛋白、液液萃取、固相萃取。采用直接沉淀蛋白法及液液萃取法处理后的样品,内源性物质干扰仍然较严重,经实验发现运用沉淀蛋白加固相萃取处理,能较好消除内源性物质的干扰,回收率高,且通过加入化学结构相近的内标的方法,避免了样品处理过程操作引起的误差,使结果更加具有重复性。固相萃取可以进行批量处理,比液-液萃取更快、更节省溶剂及时间,因此本方法简单、快速、灵敏、准确,适合大鼠血浆中CLT药动学研究。

图2 CLT血药浓度-时间曲线

表7 大鼠单剂量灌胃CLT-SMEDDS与CLT混悬液后药动学参数 n=6,±s

表7 大鼠单剂量灌胃CLT-SMEDDS与CLT混悬液后药动学参数 n=6,±s

与CLT混悬液比较,*1P＜0.01

药物Cmax/ (ng·mL-1) tmax/ h AUC(0～48)/ (mg·mL-1·h) t1/2αt1/2βt1/2κα h kα/ h-1CLT混悬液181.22±12.773.62±0.512 173.08±242.352.56±0.3711.82±0.891.57±0.500.57±0.11 CLT-SMEDDS278.53±40.48*12.81±0.44*14 205.61±297.59*13.21±0.42*119.01±4.26*10.78±0.43*10.92±0.24*1

根据赤池信息量准则(Akaike information criterion, AIC)最小原则[5],CLT在体内的药动学过程符合二室模型。结果表明,相同剂量CLT-SMEDDS口服后,达峰时间tmax较CLT混悬液提前1 h,AUC(0～48)较CLT明显增加,且相对生物利用度(F)=(AUCSMEDDS/ DSMEDDS)/(AUC混悬剂/D混悬剂)×100%,结果为194%,表明CLT-SMEDDS在体内的起效快,吸收更好,生物利用度较普通制剂有更大提高。原因可能有以下几点:①提高了药物溶解度,改善了溶出;②SMEDDS所形成的平均粒径较小,与小肠吸收部位的接触面积相对较大;③SMEDDS中存在大量表面活性剂(一般占体系总量的20%～60%),其表面张力较低而易于通过胃肠壁的水化层,药物能直接和胃肠上皮细胞接触,增加对肠道上皮细胞的穿透性,促进药物的吸收;④CLTSMEDDS遇水形成微乳液,且处方中含有长链脂肪酸IPM,可刺激乳糜微粒生成,促进淋巴转运[6]。

另外,CLT-SMEDDS口服后消除半衰期(t1/2β)= (19.01±4.26)h,与CLT混悬剂组存在显著差异,且较长,其可能是由于长链脂肪酸酯IPM或其代谢物肉豆蔻酸对胃的排空过程起抑制作用,使滞留时间延长[3]。检测中,口服CLT混悬剂后,48 h不能从血浆中测出CLT,表明药物几乎从血液中完全消除,相对于CLTSMEDDS给药后消除更快。

[1] 申屠建中,周慧丽,黄明珠,等.RP-HPLC测定人血浆中CLT浓度[J].药物分析杂志,2006,26(4):473-475.

[2] HONG J Y,KIMJ K,SONG Y K,et al.A newself emulsifying formulation of itraconazole with improved dissolution and oral absorption[J].J Controled Release,2006,110(2): 332.

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[5] 陈兴钩.统计模型用AIC准则定阶的相容性[J].华侨大学学报自然科学版,1989,10(11):6-10.

[6] CRAIG D M.The use of self-emulsifying systems as a means of improving drug delivery[J].B T Gatefosse,1993,86 (12):21-31.

DOI 10.3870/yydb.2014.07.011

R978.1;R965

A

1004-0781(2014)07-0881-04

2013-07-18

2013-09-11

邱妍川(1982-),女,湖北荆门人,讲师,硕士,主要研究方向:新剂型与新制剂。E-mail:christiana42@163. com。

朱照静(1962-),男,重庆大足人,教授,博士,主要研究方向:新剂型与新制剂。E-mail:zhaojing6271@126. com。