耐辐射球菌对Cu2+的去除效率

韩万春，李铭锋，田 兵，华跃进，卢振兰

(1.吉林农业大学资源与环境学院，吉林长春， 130118;2.浙江大学原子核农业科学研究所，浙江杭州 310029;3.山东省东营市环境保护局，山东东营 257000)

耐辐射球菌对Cu2+的去除效率

韩万春1，李铭锋2，3，田 兵2，华跃进2，卢振兰1

(1.吉林农业大学资源与环境学院，吉林长春， 130118;2.浙江大学原子核农业科学研究所，浙江杭州 310029;3.山东省东营市环境保护局，山东东营 257000)

耐辐射球菌是一种非致病菌，拥有极强的抗辐射、抗氧化特性，具有成为工程菌处理Cu2+的潜力。采用酶标仪测定Cu2+对耐辐射球菌的生长速度的影响，用电感耦合等离子光谱法测定菌液离心后得到的上清液Cu2+浓度。结果表明，当Cu2+初始质量浓度为1.36 mg/L时，耐辐射球菌对其清除效率为57.3%;当Cu2+初始质量浓度为6.28mg/L时，对其清除效率为35.4%。此外，用激光共聚焦显微镜观察受到Cu2+胁迫的耐辐射球菌，发现球菌具有明显的聚集效应。

耐辐射球菌;Cu2+;电感耦合等离子光谱法;去除效率

Cu2+污染存在于电镀、冶金、化工等行业已早为人熟知。人体摄入过量Cu2+会引起一系列病变，急性Cu2+中毒可引起胃肠道黏膜刺激症状，恶心、呕吐、腹泻，甚至溶血性贫血、肝功能衰竭、休克、昏迷或死亡，慢性摄入过高的Cu2+，可引起儿童肝硬化;土壤中过量的Cu2+可间接污染农产品，Cu2+对水培青菜幼苗生长影响很大［1］;Cu2+对玉米生长的影响同样严重，当c(Cu2+)=50 μmol/L时，边缘细胞的死细胞数量达758个(存活率为24.8%)，当c(Cu2+)=100 μmol/L 时，存活率降低了17.54%［2］;Cu2+对鲫鱼红细胞、白细胞和血红蛋白影响较大［3］，它通过食物链威胁人体健康，并造成环境的二次污染［4］。

目前，人们已经提出了众多去除Cu2+的方法。董静［5］采用吸附法去除 Cu2+，左鸣等［6］提出用铁氧体法去除废水中的Cu2+，刘泊良等［7］采用改性碳纳米管对水中Cu2+的去除作用，朱一民等［8］采用海藻酸钠吸附Cu2+，滕洪辉等［9］采用纳米光催化还原去除水中Cu2+。

耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)是Anderson等人于1956年在用x射线给腐败的灌装食品灭菌时发现的非致病性红色球菌［10］，被誉为地球上最顽强的细菌之一［11］，该细菌具有惊人的电离辐射抗性和DNA修复能力，其辐射耐受剂量是大肠杆菌的几百倍，是人类的几千倍，具有耐辐射、抗氧化、非致病菌的优良特性［12-13］。本研究正是基于耐辐射球菌如此多的优良特性的基础上而展开的。GB 25467-2010《铜、镍、钴工业污染物排放标准》规定，企业废水总排放二级处理后的Cu2+质量浓度不超过2.0 mg/L，如果将耐辐射球菌作为废水排放中Cu2+二级处理的工程菌株，可为微生物清除Cu2+污染提供条件［14］，将在环境修复方面上具有一定的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选用耐辐射球菌作为工程菌、大肠杆菌作为对照菌株;TGY培养基(TRYPTONE 0.5%、YEAST 0.3%、D-glucose 0.1%，pH=6.4±0.2)用于培养耐辐射球菌;LB(TRYPTONE 0.1%、YEAST 0.5%、NaCL 0.10%，pH=7.5±0.2)用于培养大肠杆菌;用Spectra Max M5测定OD600值;用PerkinElmer公司生产的 OpticalEmission Spectrometer optima 7300DV测定Cu2+浓度。

1.2 试验方法

a.样本前处理时，将耐辐射球菌划平板，挑单菌落到5mL TGY培养基中30℃下培养，试验在无菌操作台进行。

b.取1 mL培养好的菌液加入到200 mL的TGY培养基中，为保证初始培养基中菌体浓度相等，菌液培养到OD600=0.57。把摇好的菌分装到20 cm灭菌试管中，每管5 mL。再分别加入10μL、50 μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)到试管中，每样品做3次重复，利用酶标仪测定不同时间下的OD600的值。

c.用激光共聚焦显微镜观察Cu2+处理后的耐辐射球菌的细胞聚集情况［15］。

d.利用电感耦合等离子光谱法(ICP-OES)测定培养基中Cu2+浓度，以计算耐辐射球菌对Cu2+的去除效率［16］。

初始样测定:①将10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培养基中，ICP-OES检测出Cu2+质量浓度为1.36 mg/mL。②将50 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5mL的TGY培养基中，ICP-OES检测出Cu2+质量浓度为6.28 mg/mL。

处理样测定:① 将10 μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培养基中，加入2 μL耐辐射球菌，生长到衰亡期，经处理后，ICP-OES检测出Cu2+质量浓度为0.58mg/mL。②将50μL的Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)溶液加到5 mL的TGY培养基中，加入2 μL耐辐射球菌，生长到衰亡期，经处理后，ICP-OES检测出Cu2+质量浓度为4.06mg/mL。

2 试验结果与分析

分析初始样与处理样Cu2+浓度之间的关系，并计算出耐辐射球菌对Cu2+的去除效率。用origin 75软件绘制出不同Cu2+浓度对耐辐射球菌生长影响的生长曲线。

2.1 生长曲线的测定

向试管中加入Cu2+在一定程度上会影响耐辐射球菌的生长。为此利用酶标仪测定Cu2+胁迫下的耐辐射球菌生长曲线，以了解耐辐射球菌的生长状况，如图1所示。

图1 Cu2+对耐辐射球菌生长的影响

耐辐射球菌初始透光度(OD600)为0.57时，加入不同浓度的Cu2+30℃培养。由空白样本与Cu2+作用生长曲线可以看出，Cu2+用量对耐辐射球菌的生长影响小。重复多次试验后用平板计数方法统计出，当OD600值为1.0时，1 mL菌液中耐辐射球菌的个数为108个。

为了说明Cu2+浓度对其他菌体的影响，测定Cu2+浓度对模式生物大肠杆菌的生长影响:当大肠杆菌在37℃LB培养基中，其OD600为0.24时，不同浓度的Cu2+对大肠杆菌的生长影响如图2所示。

试验结果表明，在大肠杆菌的生长过程中，Cu2+浓度对其生长具有促进作用。换言之，大肠杆菌对Cu2+浓度不敏感。但GB3838-2002《地表水环境质量标准》中明确提出了对粪大肠杆菌群的规定，因为其有一定的致病性，所以不能作为污水处理的工程菌。

图2 Cu2+对大肠杆菌的生长影响

2.2 耐辐射球菌的聚集效应

在Cu2+的作用下，耐辐射球菌出现了聚集现象(图3)。

图3 耐辐射球菌聚集现象

由于Cu2+的胁迫，耐辐射球菌出现聚集现象。这可能是因为耐辐射球菌存在群体感应机制，以抵抗外来的胁迫。有文献表明，这可能与某种金属离子通道有关［4］。

2.3 不同浓度Cu2+作用下的菌体质量变化

试验结果表明，耐辐射球菌对Cu2+有很强的耐受能力。按照表1数据向200 mL TGY培养基中加入各种浓度的Cu2+，培养48 h，精确量取100 mL菌液，离心30 min后(10000 r/min)收集菌体，把收集到的菌体用真空冷冻干燥仪干燥，称取质量。

表1 不同浓度Cu2+加入后得到的菌体干质量

随着Cu2+质量浓度的不断增加，耐辐射球菌的菌体干质量不断减少。Cu2+质量浓度低时，对耐辐射球菌的生长影响不大，但Cu2+质量浓度达到5.12 mg/L 时，即1600 μL Cu2+(c(Cu2+)=10 mmol/L)加入时，耐辐射球菌菌量开始快速下降。用SPSS18.0软件进行显著性分析，P值为9.06×10-7，远小于0.5，效果显著。

2.4 耐辐射球菌对Cu2+的去除效率

计算耐辐射球菌对Cu2+的去除率:

式中:ρ0为Cu2+初始质量浓度，mg/L;ρ为加入耐辐射球菌后的Cu2+质量浓度，mg/L。

当10μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培养基中时，Cu2+质量浓度为1.36mg/L，加入700μL耐辐射球菌处理后，经ICP-OES测得Cu2+质量浓度为0.58 mg/L，则去除率r1=(1-0.58/1.36)×100%=57.3%。

当50μL Cu2+(c(Cu2+)=10mmol/L)加入培养基中时，Cu2+质量浓度为6.28mg/L，加入700μL耐辐射球菌处理后，经ICP-OES测得Cu2+质量浓度为4.06 mg/L，则去除率r2=(1-4.06/6.28)×100%=35.4%。

由去除率可知，Cu2+的初始浓度越高，耐辐射球菌对Cu2+去除效率越低。

3 结语

采用酶标仪及ICP-OES等方法测定耐辐射球菌在Cu2+胁迫下生长曲线变化状况及耐辐射球菌对Cu2+去除效率的研究。结果表明，耐辐射球菌对Cu2+具有很强的耐受能力;在Cu2+作用下耐辐射球菌有聚集现象;当Cu2+初始质量浓度为1.36 mg/L时，耐辐射球菌对Cu2+的去除率为57.3%;Cu2+初始质量浓度为6.28 mg/L时，耐辐射球菌对Cu2+的去除率为35.4%;耐辐射球菌具有作为企业二级处理时的工程菌的能力。企业可将耐辐射球菌作为处理含Cu2+废水的工程菌，使处理后的水质达到GB25467-2010《铜、镍、钴工业污染物排放标准》的要求。今后，将用分子生物学手段进一步对Cu2+作用下耐辐射球菌的聚集现象进行研究，从而揭示其产生机理。

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Removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans

HAN Wanchun1，LI Mingfeng2，3，TIAN Bing2，HUA Yuejin2，LU Zhenlan1
(1.College of Resources and Environment，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China;2.Institute of Nuclear Agricultural Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China;3.Dongying Environmental Protection Agency of Shandong Province，Dongying 257000，China)

As a non-pathogenic bacteria，Deinococcus radiodurans is extremely resistant to ionizing radiation and oxidative stress and shows great potential in remediation of Cu2+pollution.In this study，we used the ELIASA plate reader and the ICP-OES，respectively，to monitor the growth rate of Deinococcus radiodurans and the Cu2+concentration in the supernatant after the bacterial solution was centrifuged.The results show that the removal efficiency of Cu2+by Deinococcus radiodurans reached 57.3%when the initial concentration of Cu2+was 1.36mg/L，and the removal efficiency dropped to 35.4%when the initial concentration of Cu2+increased to 6.28 mg/L.Meanwhile，using confocal laser scanning microscopy(CLSM)，we observed that Deinococcus radiodurans assembled at a high concentration of Cu2+.

Deinococcus radiodurans;Cu2+;ICP-OES;removal efficiency

X703.1

A

1004-6933(2014)01-0064-04

10.3969/j.issn.1004-6933.2014.01.013

国家自然科学基金(30830006，31170079)

韩万春(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为环境管理与规划。E-mail:hs19880208@163.com

卢振兰，教授。E-mail:zhenlan0431@163.com

(收稿日期:2013-06-21 编辑:高渭文)