红凤菜新鲜茎叶中总黄酮提取物的LC-MS分析

任冰如,吕 寒,陈 剑,梁呈元,吴菊兰,李维林

〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园)江苏省药用植物研究开发中心江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心,江苏南京210014〕

红凤菜新鲜茎叶中总黄酮提取物的LC-MS分析

任冰如,吕 寒,陈 剑,梁呈元,吴菊兰,李维林①

〔江苏省·中国科学院植物研究所(南京中山植物园)江苏省药用植物研究开发中心江苏省抗糖尿病药物筛选技术服务中心,江苏南京210014〕

红凤菜;LC-MS;总黄酮;槲皮素;山柰酚

红凤菜(Gynura bicolor DC.)为菊科(Compositae)菊三七属(Gynura Cass.)植物,别名血皮菜、观音菜、观音苋、紫背天葵等,主要分布于中国南方各地,全草均可入药[1];也可作为蔬菜食用,在国内多个地区均有栽培和销售。目前已知红凤菜含有黄酮类、酚性酸类、萜类、甾醇类、脂肪酸类、生物碱类及花青素类等[2-7]成分。由于黄酮类成分多具有保护心血管、抗肿瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗病毒等作用[8],因此对红凤菜中黄酮类成分的研究具有深度开发价值。

作者采用“乙醇提取-大孔树脂柱层析-聚酰胺柱层析-重结晶”方法从红凤菜新鲜茎叶中提取获得不同分离阶段的黄酮类化合物,并采用LC-MS技术结合薄层层析对其进行检测分析,考察提取分离过程中黄酮类化合物的富集和纯化状况,以期为红凤菜中黄酮类化合物高效提取纯化工艺的建立提供基础实验数据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试红凤菜取自江苏省·中国科学院植物研究所实验苗圃,于2003年7月引自重庆,凭证标本保存于江苏省·中国科学院植物研究所标本馆(NAS),凭证标本号为0648614。

使用的乙腈(美国Fisher公司)和甲酸(美国Tedia公司)均为色谱纯级;采用Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备超纯水。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液制备 参照陈剑[5]的方法从红凤菜中分离制得黄酮苷类对照品芦丁(rutin)、异槲皮苷(isoquercitrin)和紫云英苷(astragalin)以及有机酸类对照品异绿原酸A (isochlorogenic acid A)和异绿原酸C(isochlorogenic acid C),上述5个对照品均通过NMR、MS和文献比对等进行结构鉴定。分别取各对照品适量,用甲醇配成质量浓度0.1 mg·mL-1的对照品溶液。

1.2.2 总黄酮成分的分离及样品溶液的制备 取红凤菜新鲜茎叶5 kg,用20 L体积分数95%乙醇室温冷浸提取7 d,提取液减压浓缩并冷沉去杂。上清液上NKA大孔树脂柱,依次用2倍体积的水以及体积分数30%、50%、70%和95%乙醇进行梯度洗脱;以BAW〔V(正丁醇)：V(乙酸)：V(水)=4：1：5〕为展开剂、质量体积分数1%A lCl3为显色剂对洗脱液进行聚酰胺薄层层析;合并具有黄酮反应的洗脱液,减压浓缩至无醇味。取一部分洗脱液在沸水浴上蒸干,得到样品Ⅰ;另一部分洗脱液进行聚酰胺柱层析,依次用2倍体积的水以及体积分数30%、50%、70%和95%乙醇梯度洗脱,收集洗脱液,每流份为1/10柱床体积,减压浓缩后室温放置,至黄酮结晶析出后,过滤,将滤液合并后进行干燥,得到样品Ⅱ,同时得到不同流份的结晶即样品Ⅲ和样品Ⅳ。各样品均取5 mg,分别用体积分数80%甲醇溶解并定容至10mL,用孔径0.22μm微孔滤膜过滤,即为供试样品溶液。

1.2.3 LC-MS检测条件 参照文献[5]、使用Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC-MS超高效液相-精确飞行时间质谱联用仪(美国Agilent公司)进行LC-MS分析。

色谱分析条件:AgilentZorbaxSB-C18色谱柱(100mm× 4.6mm,1.8μm,美国Agilent公司);流速0.5 mL·min-1,柱温25℃,进样量5.0μL。流动相A为乙腈、流动相B为体积分数0.1%甲酸溶液,梯度洗脱过程:0～30 m in,5%～40%A; 30～40 min,40%～100%A;40～45 min,100%～5%A。紫外采集数据范围为200～400 nm,检测波长360 nm。

质谱分析条件:ESI负离子模式,喷雾气压力50 psig,干燥气流速10 L·min-1,干燥气温度350℃,毛细管电压3 500 V;碎裂电压175 V;扫描范围(m/z)50～1 000。

表1 红凤菜新鲜茎叶总黄酮提取物的LC-MS分析结果Table 1 LC-MS analysis result of total flavonoids extracts from fresh stem and leaf of Gynura bicolor DC.

2 结果和分析

2.1 红凤菜总黄酮提取物的组成成分解析

红凤菜新鲜茎叶总黄酮提取物的LC-MS检测结果见表1,表中的化合物名称根据对照品和样品的LC-MS图谱、保留时间(Rt)和负离子模式下一级质谱的分子离子峰[M-H]-并结合文献[4-5]中的数据确定。

根据对照品的质谱信息,鉴定出1号峰(Rt17.64 min, [M-H]-m/z609)为芦丁,3号峰(Rt18.60 min,[M-H]-m/z 463)为异槲皮苷,6号峰(Rt 20.35 min,[M-H]-m/z447)为紫云英苷。因作者采用的LC-MS检测条件与文献[5]完全一致,故参照文献[5]确定样品中其余黄酮苷类成分分别为:3号峰(Rt18.67 m in,[M-H]-m/z 593)为山柰酚-3-O-洋槐苷(kaempferol-3-O-rubinobioside),4号峰(Rt19.31 min,[M-H]-m/z593)为山柰酚-3-O-芸香苷(kaempferol-3-O-rutinoside),5号峰(Rt19.72min,[M-H]-m/z447)为山柰酚-3-O-半乳糖苷(kaempferol-3-O-galactoside)。

表1分析结果显示:红凤菜中的黄酮苷多以槲皮素或山柰酚为苷元,其连接的糖包括六碳醛糖〔如D-葡萄糖(D-glucose)或D-半乳糖(D-galactose)〕和甲基五碳糖〔如L-鼠李糖(L-rhamnose)〕。鉴于样品Ⅰ和样品Ⅱ的1号峰呈不对称肩峰,故推测1号峰(Rt17.64 min,[M-H]-m/z609)除含芦丁外,还含有槲皮素-3-O-洋槐苷(quercetin-3-O-rubinobioside); 2号峰(Rt 18.35 min,[M-H]-m/z463)和与其相邻的异槲皮苷具有相同的分子量,故推测其为金丝桃苷(hyperoside)。

2.2 红凤菜总黄酮提取物的分离效果分析

由表1还可见:样品Ⅰ除了具有6组黄酮苷吸收峰外,还有3个包含4种成分的杂质峰(即7～9号峰),对照文献[5],确定7号峰(Rt 20.81 min,[M-H]-m/z515)为异绿原酸A (isochlorogenic acid A),8号峰(Rt 21.66 min,[M-H]-m/z 515)为异绿原酸C(isochlorogenic acid C),另外2种成分尚未能确定。样品Ⅰ经过聚酰胺柱层析得到的样品Ⅱ中不含有7～9号杂质峰,且保留了6个黄酮苷吸收峰,说明聚酰胺柱层析可有效纯化红凤菜的黄酮苷提取物。

样品Ⅲ含有1号峰(Rt 17.64 min,[M-H]-m/z 609)、3号峰(Rt 18.67 min,[M-H]-m/z 593)和4号峰(Rt 19.31min,[M-H]-m/z 593)3个峰信号;样品Ⅳ含有2号峰(Rt 18.35min,[M-H]-m/z463)、3号峰(Rt18.60 min,[M-H]-m/z463)、5号峰(Rt 19.72 min,[M-H]-m/z447)和6号峰(Rt20.35 m in,[M-H]-m/z447)4个峰信号。与样品Ⅰ不同的是,样品Ⅲ中的1号峰为对称的峰信号,3号峰只有1个分子离子峰信号([M-H]-m/z 593),而样品Ⅳ中的3号峰也只有1个分子离子峰信号([M-H]-m/z463)。以上结果说明,采用聚酰胺柱层析结合重结晶方法可使红凤菜中的不同黄酮苷成分得到较好的分离。

3 讨 论

在上述获得的黄酮苷成分中,槲皮素-3-O-洋槐苷和槲皮素-3-O-半乳糖苷在红凤菜化学成分的相关研究中未见报道,造成这一结果的原因除与分离手段不同有关外,还与供试样品的性质不同有关。前人的研究多采用红凤菜干燥叶片,而作者采用的是红凤菜新鲜茎叶,采用新鲜植物样品能更全面地保留原有的化学成分。虽然如此,还应采用其他分析手段对红凤菜中上述2种成分进行进一步的验证。

此外,从红凤菜新鲜茎叶中分离或检测到的黄酮苷成分主要以槲皮素或山柰酚为苷元,这与他人的研究结果[2-5]一致。因此,在测定红凤菜总黄酮成分时建议将样品中的黄酮苷进行酸水解,并以槲皮素和山柰酚为对照品采用高效液相法进行定量测定,以获得较准确的结果。

采用“体积分数95%乙醇提取-NKA大孔树脂柱层析-聚酰胺柱层析-重结晶”的工艺流程可有效地从红凤菜新鲜茎叶中分离获得总黄酮,该工艺能耗低、操作简便、产品纯度高,可用于工厂化生产。

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(责任编辑:佟金凤)

不同种植模式对滇龙胆草总裂环烯醚萜苷含量的影响

李远菊1,2,沈 涛3,张 霁1,赵艳丽1,王元忠1,①

(1.云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明650200;2.云南中医学院中药学院,云南昆明650500; 3.玉溪师范学院资源环境学院,云南玉溪653100)

Abstract:Effect of different planting patterns on total secoiridoid glycoside content in different parts of Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.was researched.The results show that different planting patterns have significant or extremely significant effects on total secoiridoid glycoside content in root,stem and leaf of G.rigescens.Total secoiridoid glycoside content in root is the highest under planting pattern of G.rigescens-Alnus nepalensis D.Don and is the lowest under p lanting pattern of G.rigescens-Chaenomeles sinensis(Thouin)Koehne,that in stem is the highest under single p lanting pattern of G.rigescens and is the lowest under planting pattern of G.rigescens-Juglans regia Linn.,and that in leaf is the highest under planting pattern of G.rigescens-Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.and is the lowest under single planting pattern of G.rigescens.

关键词:滇龙胆草;复合种植;总裂环烯醚萜苷含量

Key words:Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.;complex planting;total secoiridoid glycoside content

DOI:10.3969/j.issn.1674-7895.2014.03.16

滇龙胆草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana Linn.)多年生草本植物,主要分布于云南、四川、贵州、湖南和广西等地,生长于山坡、草地、灌丛、林下及山谷中[1]。该种为传统中药龙胆的基源植物,其干燥根及根茎均可入药,具有清热燥湿和泻肝胆火的功效[2]。因其资源需求量逐年增加,滇龙胆草的人工种植越来越普遍,并出现了多种种植模式[3]。目前滇龙胆草主要种植模式有单一种植和林药复合种植,常见的有滇龙胆草与茶树〔Camellia sinensis(Linn.)Kuntze〕、桉树(Eucalyptus robusta Smith)、木瓜〔Chaenomeles sinensis(Thouin)Koehne〕和旱冬瓜(Alnus nepalensis D.Don)的复合种植模式[4]。与传统林业系统相比,林药复合系统具有良好的生态效益、社会效益和经济效益[5]。周幸[6]的研究结果表明:在太行山山地林药复合种植模式中,分布于土壤表层的药用植物浅根系对表层土有加筋固着作用,可减少水土流失。Sujatha等[7]认为:在槟榔(Areca catechu Linn.)园间作芳香药用植物有助于提高其产量并增加单位面积收入。目前有关林药复合种植的研究主要集中于其生态效益和经济效益,对复合种植模式下药用植物有效成分变化的研究尚不多见[8-9]。

裂环烯醚萜苷是龙胆科药用植物的特征性成分,主要有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷等[10-11],是龙胆药材的主要药效成分[12-14]。作者以滇龙胆草中总裂环烯醚萜苷含量为评价指标,分析不同种植模式对其不同部位总裂环烯醚萜苷含量的影响,为滇龙胆草复合种植模式的实施提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料 供试样品于2012年10月采集自云南临沧滇龙胆栽培样地,所有样品均栽培2 a。共设置8种种植模式,包括单一种植以及滇龙胆草与茶树、桉树、木瓜、旱冬瓜、核桃(Juglans regia Linn.)、杉木〔Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook.〕及木果柯〔Lithocarpus xylocarpus(Kurz)Markgraf〕复合种植。每种模式样地面积48m2,样地年平均气温18.5℃,年平均降水量1 158 mm。不同种植模式按五点取样法进行取样,并由云南省农业科学院药用植物研究所张金渝研究员鉴定;取样后每个样地随机选取10株,每株分成根、茎和叶片3部分,分别置于50℃条件下干燥至恒质量,粉碎后过100目筛,备用。

1.1.2 仪器与试剂 UV-2550型紫外分光光度计(日本岛津公司),SY3200-T型超声波清洗器(上海声源超声波仪器设备有限公司),AR1140万分之一分析天平(美国奥豪斯公司), FW-100高速万能粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂),UPTI-10L优普超纯水机(成都优越科技有限公司)。龙胆苦苷对照品(批号110770-201314,纯度96.9%)购自中国药品生物制品检定所;乙醇为分析醇,蒸馏水自制。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液及样品溶液制备 称取龙胆苦苷对照品3.0mg,用体积分数70%乙醇配制成60μg·mL-1对照品溶液。分别称取各种植模式下滇龙胆草不同部位样品粉末25.0 mg,加入体积分数70%乙醇10 mL,超声(功率150W)提取40 m in,过滤;取滤液5.0 mL,用体积分数70%乙醇定容至50 mL,即为质量浓度250μg·mL-1的供试样品溶液。

1.2.2 测定波长的选择 分别取上述龙胆苦苷对照品溶液和样品溶液,以体积分数70%乙醇为空白,在波长190～400 nm范围内扫描,两者均在波长270 nm处有最大吸收峰,故选择270 nm为检测波长。

1.2.3 对照品线性关系考察 分别取对照品溶液1.0、3.0、4.0、5.0和8.0 mL,分别用体积分数70%乙醇定容至10 mL,以体积分数70%乙醇为空白,于波长270 nm处测定吸光度值;以吸光度值(A)为纵坐标、对照品质量浓度(C)为横坐标绘制标准曲线:A=0.023 08C-0.005 81(r=0.999 7),龙胆苦苷在质量浓度6.0～48.0μg·mL-1范围内线性关系良好。

1.2.4 样品溶液测定 取上述各样品溶液,以体积分数70%乙醇为空白,于波长270 nm处测定吸光度值,平行测定3次,根据标准曲线计算样品中总裂环烯醚萜苷含量。

1.2.5 方法学考察 精密吸取质量浓度24μg·mL-1的对照品溶液,测定波长270 nm处的吸光度值,重复测定5次,RSD为0.15%,结果表明该方法精密度良好。

精密吸取同一样品溶液,分别在0、1、2、3和4 h测定波长270 nm处的吸光度值,总裂环烯醚萜苷含量分别为122.62、120.58、122.56、126.32和125.14μg·mg-1,平均含量为123.44μg·mg-1,RSD为1.85%,结果表明该样品溶液稳定性良好。

分别称取同一批样品粉末6份,按上述方法制备样品溶液并测定吸光度值,RSD为1.97%,结果表明该方法重复性良好。

称取总裂环烯醚萜苷含量为119.856μg·mg-1的样品粉末20.0 mg,称取6份,按上述方法制备样品溶液;然后分别加入质量浓度97.71μg·mL-1龙胆苦苷对照品溶液1.0、1.0、2.0、2.0、3.0和3.0 mL,用体积分数70%乙醇定容至25 mL,于波长270 nm处测定吸光度值并计算总裂环烯醚萜苷含量;样品中龙胆苦苷的平均回收率达到98.83%,RSD为3.39%,表明该方法的回收率较高。

1.3 数据统计和分析

采用EXCEL 2003和SPSS 11.5统计分析软件对实验数据进行方差分析和多重比较分析。

2 结果和分析

不同种植模式下滇龙胆草不同部位总裂环烯醚萜苷含量见表1。

由表1可知:滇龙胆草根中的总裂环烯醚萜苷含量在滇龙胆草-木瓜种植模式下最低(82.03μg·mg-1),而在滇龙胆草-旱冬瓜和滇龙胆草-核桃种植模式下较高(分别为105.52和102.88μg·mg-1),前者与后2种复合种植模式间差异显著(P＜0.05);在7种复合种植模式中,除滇龙胆草-木瓜种植模式外,在其他复合种植模式下根中总裂环烯醚萜苷含量均高于滇龙胆草单一种植模式。

茎中的总裂环烯醚萜苷含量在滇龙胆草单一种植模式下最高(80.46μg·mg-1),在滇龙胆草-旱冬瓜种植模式下也较高(73.66μg·mg-1),而在滇龙胆草-核桃种植模式下则最低(60.53μg·mg-1);在7种复合种植模式中,除滇龙胆草-旱冬瓜、滇龙胆草-木果柯种植模式外,在其余种植模式下茎中总裂环烯醚萜苷含量均显著低于滇龙胆草单一种植。

表1 不同种植模式下滇龙胆草不同部位总裂环烯醚萜苷含量的比较(¯X±SD,n=10)1)Table 1 Comparison of totalsecoiridoid glycoside content in different parts of Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.under different p lanting patterns(¯X±SD,n=10)1)

叶片中总裂环烯醚萜苷含量在滇龙胆草-杉木种植模式下最高(109.26μg·mg-1),在滇龙胆草单一种植模式最低(仅为66.75μg·mg-1);在7种复合种植模式中,在滇龙胆草-杉木、滇龙胆草-木瓜、滇龙胆草-桉树种植模式下叶片中总裂环烯醚萜苷含量显著高于滇龙胆草单一种植模式,而在其他复合种植模式下叶片中总裂环烯醚萜苷含量与滇龙胆草单一种植模式差异不显著。

由表1还可知:不同种植模式下滇龙胆草根、叶片和茎中总裂环烯醚萜苷平均含量依次降低,分别为92.97、84.45和68.44μg·mg-1。方差分析结果表明:种植模式对滇龙胆草根中总裂环烯醚萜苷含量有显著影响,对茎和叶片中总裂环烯醚萜苷含量有极显著影响(P＜0.01)。

3 讨论和结论

药用植物药效成分的产生和积累受生态环境因素影响[15]。权秋梅等[16]的研究结果表明:不同生境中柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim.)有效成分有差异,在光照强度较高的生境中其总黄酮和淫羊藿苷含量高于光照强度较低的生境。曹建华等[17]认为:适宜的间作复合生态系统可以改善生态环境小气候。因而,推测不同种植模式下滇龙胆草体内总裂环烯醚萜苷含量变化可能与其生长的小环境有关。

滇龙胆草的主要药用部位为根部,在不同种植模式下,除滇龙胆草-木瓜种植模式外,在其余复合种植模式下滇龙胆草根中总裂环烯醚萜苷含量均高于单一种植模式,其中在滇龙胆草-旱冬瓜种植模式下滇龙胆草根中总裂环烯醚萜苷含量最高,但由于桉树和旱冬瓜叶片水提物对滇龙胆草种子萌发有显著抑制作用[4],因此,滇龙胆草与茶树、核桃、杉木及木果柯复合种植较为适宜。

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(责任编辑:张明霞)

LC-MS analysis of total flavonoids extracts from fresh stem and leaf of Gynura bicolor

REN Bingru,LYU Han, CHEN Jian,LIANG Chengyuan,WU Julan,LIWeilin①(Jiangsu Center for Research and Development of Medicinal Plants,Jiangsu Provincial Service Center for Anti-diabetic Drugs Screening,Institute of Botany,Jiangsu Province and the Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210014,China),J.Plant Resour.&Environ.2014,23(3):108-110

Four total flavonoids extractswere obtained from fresh stem and leaf of Gynura bicolor DC.bymethod of ethanol extraction-macroporous resin column chromatography-polyamide column chromatography-recrystallization,and their compositions were analyzed by LC-MS technology.The results show that there are six groups of flavonoid absorption peak in total flavonoids extracts of G.bicolor,which is identified to be eight components including rutin,quercetin-3-O-rubinobioside,hyperoside,isoquercitrin,kaempferol-3-O-rubinobioside,kaempferol-3-O-rutinoside,kaempferol-3-O-galactoside and astragalin.This extractionmethod can effectively extract and purify total flavonoids from fresh stem and leaf of G.bicolor,so it can be used for factory production.

Gynura bicolor DC.;LC-MS;total flavonoids;quercetin;kaempferol

E ffect of different p lanting patterns on total secoiridoid glycoside content in

Gentiana rigescens LI Yuanju1,2, SHEN Tao3,ZHANG Ji1,ZHAO Yanli1,WANG Yuanzhong1,①(1.Institute of Medicinal Plants,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650200,China;2.College of Traditional Chinese Medicine,Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China;3.College of Resources and Environment,Yuxi Normal University,Yuxi653100,China),J.Plant Resour.&Environ.2014,23(3):111-113

Q946.83;R284.1

A 文章编号:1674-7895(2014)03-0108-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2014.03.15

946.83;Q949.776.4;R282.2 文献标志码:A

1674-7895(2014)03-0111-03

2013-09-29

江苏省产学研联合创新资金项目(BY2012213);江苏省科技基础设施建设计划——科技公共服务平台项目(BM2011117)

任冰如(1964—),女,江苏宜兴人,博士,研究员,主要从事植物资源的研究与开发工作。

①通信作者E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net

收稿日期:2013-10-08

基金项目:国家自然科学基金资助项目(81260608);国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAI13B02-04);云南省技术创新人才培养项目(2010CI068);云南省科技计划项目(2012AE002);云南省自然科学基金资助项目(2013FZ150;2013FZ151);2012年度国家中药材生产扶持项目(41);国家农业部公益性行业科研专项(201303117)

作者简介:李远菊(1989—),女,云南丽江人,硕士研究生,主要从事中药资源开发与利用研究。

①通信作者E-mail:boletus@126.com