心脏组织特异性表达Neuregulin-2转基因小鼠的建立及心脏功能分析

路迎冬，鲍 丹，刘 宁，张 旭，马元武，吕 丹，张连峰

（中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

心脏组织特异性表达Neuregulin-2转基因小鼠的建立及心脏功能分析

路迎冬，鲍 丹，刘 宁，张 旭，马元武，吕 丹，张连峰

（中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

目的 神经调节蛋白2（neuregulin-2，NRG2）可促进神经系统发育，基因缺失表现早期生长延迟，NRG2在心脏中也有表达，但其在心脏发育尤其是病理刺激时对心脏结构及功能的影响尚未见报道。本文目的是建立心脏组织特异性表达NRG2转基因小鼠，分析其在正常及压力负荷刺激时对心脏结构及功能的影响。方法将人NRG2基因插入到心脏特异性启动子α-MHC下游，构建转基因表达载体，显微注射法建立NRG2转基因小鼠，PCR鉴定转基因小鼠基因型，western blot鉴定NRG2蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系，主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）制备压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型。利用超声影像分析和病理学观察小鼠心脏结构和功能改变。结果 建立了心脏组织特异性高表达NRG2转基因小鼠品系。与同窝阴性转基因小鼠相比，转基因小鼠左心室舒张末期后壁厚度（LVPWD）明显增加，3月龄时可达15.6％（P＜0.05），经压力负荷刺激后，NRG2转基因手术小鼠心室壁增厚程度显著下降，心室腔增大，同时心肌排列紊乱程度和纤维化程度明显比NTG手术小鼠严重。结论 在压力负荷下，转基因表达NRG2缩短了肥厚过程，同时加速了心衰进程。

NRG2；转基因；压力负荷；心室重构

神经调节蛋白（neuregulins，NRGs）是神经系统及心脏等器官介导细胞与细胞间相互作用的信号蛋白，属于表皮生长因子家族成员，参与细胞增殖，分化及细胞形态的形成［1］，NRGs通常包括6个识别结构域，分别是N末端结构域，免疫球蛋白样结构域，糖基化富集间隔区，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样结构域，疏水跨膜结构域和羧基末端尾巴［2］。NRGs通过与酪氨酸激酶受体家族的EGF受体结合介导相应的生物学功能，包括ErbB1，ErbB2，ErbB3，ErbB4受体间通过形成同源或异源二聚体，使胞内酪氨酸激酶磷酸化，募集胞内各种磷酸酶发挥生物学作用［3，4］。目前，已知NRGs包括4个成员，分别是NRG1，NRG2，NRG3及NRG4。其中NRG1是4个成员中结构和功能研究的较为彻底的一个，NRG1主要表达于心内膜及心肌微血管内皮细胞，与心肌细胞上的ErbB受体相互作用，在心肌细胞的发育、存活及维持成熟心肌细胞的功能方面发挥重要的作用［5］。NRG4的体外试验中证实在胰腺中能够促进分泌生长激素抑制素细胞的分化，而NRG3的功能目前还不清楚［5，6］。

NRG2又称 NTAK（neural- and thymusderived activator for the ErbB kinase），Don-1 （divergent of neuregulin 1）或HRG2（heregulin2），与NRG1的同源性最高，能够直接激活 ErbB3和ErbB4，间接激活ErbB2［7］，而ErbB2和ErbB4对于维持心脏的功能具有重要作用［10］，提示NRG2可能参与心脏组织发育。然而目前尚无关于NRG2在心脏发育及相关心脏疾病调控的研究报道，在本室前期研究中发现NRG2在心脏中表达，并且心肌病发生时，其表达会发生改变，提示其可能参与的心肌病发生发展。所以本研究特建立心脏组织特异性表达NRG2转基因小鼠，分析其在正常及压力负荷刺激下对心脏结构形态及功能的影响，以期为NRG2参与心脏发育及心脏疾病的调节作用的分析提供模型动物及理论依据。

1 材料和方法

1.1 NRG2转基因载体构建及转基因小鼠模型的建立

以pCMV6-XL5-h-NRG2质粒（OriGene，美国，Clone ID NM_013983）为模板，用 PCR法扩增人NRG2 全 长 cDNA，上 游 引 物 为：5’-CCCAAGCTTATGGCCTGGCCAGATGCG，下游引物为：5’-CCGCTCGAGTCCTTAAAGATAGTGGGGCGG GC（上海英俊生物技术有限公司合成，中国）。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环。扩增片段大小为2559 bp。将扩增片段插入PMD18T载体，经测序比对正确后，以Hind III和Xho I（宝生物工程有限公司，中国）酶切回收NRG2片段，并插入到α-MHC启动子的下游构建心脏特异性表达的NRG2表达载体，再用Pvu I（宝生物工程有限公司，中国）将其线性化，Sephedex G50柱纯化 DNA片段，获得表达NRG2基因的转基因片段，注射前将转基因片段浓度调至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BC/6J小鼠的受精卵中（小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】），使用ICR小鼠作为假孕受体小鼠 （购自北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】），制备转基因小鼠（TE2000U纤维注射仪）。实验在本研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室完成【SCXK（京）2013-002】，实验中涉及动物操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用与管理委员会批准，批准号为ILAS-GC-2012-001。

1.2 PCR鉴定NRG2转基因小鼠基因型

转基因小鼠在出生7-14 d时，用剪脚趾标记法标记，收集剪下的组织，碱裂解法提取基因组DNA［11］，PCR法对首建鼠进行筛选。PCR上游引物为：NRG2-S30 5’-ATGCTGCTCTTCGGTGTGT，下游引物为：NRG2-A739 5’-CCGTCTGGCTCTTC ATCTTC。PCR反应体系20μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸10 min。扩增片段大小为433 bp。

1.3 western blot鉴定NRG2蛋白的表达

颈椎脱臼法牺牲小鼠，提取F1代转基因阳性和转基因阴性（non-transgenic，NTG）小鼠心脏组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取20μg蛋白经高温变性后，进行8％的SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至NC膜上（Millipore，美国），用含有5％脱脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris，0.05％Tween，pH 7.6）封闭NC膜，用NRG2单克隆抗体（1：1000稀释，WH0009542M，sigma，美国）检测NRG2蛋白表达水平，采用HRP-偶联的羊抗鼠抗体（1∶10000稀释，ZB-2305，康成生物，中国）结合一抗。选用HRP-偶联的β-actin单克隆抗体（1：10000稀释，KC-5A08，中杉金桥，中国）作为内参。用Image J分析软件分析western blot条带灰度。

1.4 超声影像分析

小鼠经腹腔注射三溴乙醇（18 mL/kg体重）麻醉，脱胸前区被毛，仰卧固定于加热板上，以保持体温，四肢固定，选用30Hz的探头，按住Zhou YQ［12］报道的方法进行心脏超声影像分析（Vevo770小动物超声影像系统，加拿大）。

1.5 压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型建立

采 用 主 动 脉 缩 窄 手 术 （thoracic aorta constriction，TAC）建立压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型。小鼠经腹腔注射三溴乙醇麻醉、脱毛、仰卧位固定。气管插管连至呼吸机（频率为125～150次/min）进行部分开胸手术。利用27G平头针头于无名动脉［innominate artery（IA），即头臂动脉干（brachiocephalic trunk）］ 和左颈总动脉 （left common carotid artery，LCCA）间动脉弓进行结扎，获得理论直径为 0.4 mm重建血管。假手术（Sham）小鼠动脉重建步骤外，其余步骤与TAC手术小鼠相同［13］。

1.6 病理观察

颈椎脱臼牺牲小鼠，打开胸腔取出心脏，将心脏组织固定在中性福尔马林中24h。脱水，石蜡包埋及切片，HE和 Masson［13］染色后显微镜下观察（Nikon显微镜，日本）组织学变化。

1.7 统计分析

实验数据以Mean±SD表示，用Student’s ttests或one-way ANOVA分析处理数据，P＜0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 NRG2转基因小鼠的建立

用PCR法克隆的NRG2基因，测序结果表明克隆片段同已报道的NRG2序列完全一致（Gene ID：9542）。将人的NRG2基因插入到心脏特异表达的α-MHC启动子下游，构建得到人NRG2转基因表达载体（图1A）。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到ICR假孕受体小鼠中，出生的首建鼠与野生型小鼠交配获得子代转基因小鼠。提取小鼠基因组DNA，用PCR法扩增NRG2目的基因片段，大小为433 bp，鉴定小鼠基因型（如图1B）。提取心脏组织总蛋白，用NRG2单克隆抗体进行western blot分析，Image J软件分析条带灰度，对western blot结果进行定量，结果显示转基因小鼠心脏组织NRG2的表达显著高于同龄阴性对照小鼠（NTG）（P＜0.05）（图1C和1D），同时NRG2转基因小鼠可稳定传代。

图1 α-MHC-NRG2转基因小鼠模型的建立Note：M：DNA molecular weightmarker DL2000；A，The construct of α-MHC-NRG2 expression vector.B，PCR to identify the genotype of NRG2 transgenic mouse.C，Western Blot to analysis the NRG2 expression level in heart tissue of transgenic mice，β-actin as internal reference.D，The quantitative analysis of the NRG2 protein level in heart tissue.Fig.1 The establishment ofα-MHC-NRG2 transgenicmice

2.2 NRG2转基因小鼠心脏结构和功能分析

NRG2转基因小鼠于1、3和5月龄进行心脏超声影像分析（图2），与NTG小鼠相比，左心室舒张末期内径 （left ventricular internal dimension at endiastole，LVIDD）在三个时间点变化均不明显；左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall at endiastole，LVPWD）明显增加，3月龄时可达15.6％（P＜0.05），舒张期左心室容积变化也不明显（LV end-diastolic volume，LVEDV）有微弱的增加趋势。

图2 α-MHC-NRG2转基因小鼠1、3和5月龄心脏超声表型分析Note：M：month；“▲”：NTG；“■”：NRG2.Fig.2 The echocardiography analysis ofα-MHC-NRG2 transgenic mice at1，3 and 5 months of age

2.3 压力负荷情况下NRG2转基因小鼠心脏结构和功能分析

对2月龄NRG2转基因和同窝阴性小鼠进行TAC手术处理，于术后4周对小鼠进行心脏超声影像分析（图3）。与假手术组（Sham）小鼠相比，NTG小鼠经过TAC手术处理后的LVIDD变化不明显。NTG小鼠经过TAC手术处理后的LVEDV有微弱的下降，而转基因小鼠经过 TAC手术处理后的LVEDV增加22.8％。NTG小鼠经过TAC手术处理后的LVPWD增加明显，高达37.0％，而NRG2转基因小鼠LVPWD仅增加4.1％。说明转基因表达NRG2后，心脏在压力负荷下的肥厚过程被抑制，而是表现为左心室扩大的病理表型。

图3 α-MHC-NRG2转基因小鼠TAC术后超声分析心脏表型和功能变化Note：“■”：Sham；“□”：TAC.Fig.3 Morphology and function changes after TAC treatment byechocardiography analysis

2.4 压力负荷情况下NRG2转基因小鼠心肌组织学分析

为了确定压力负荷下转基因表达NRG2对心脏的肥厚抑制作用，是抵抗了肥厚过程，还是缩短了肥厚过程而加速了心衰进程，对2月龄NRG2转基因和同窝阴性小鼠进行TAC手术处理，于术后4周时，对小鼠的心脏进行病理组织学观察，分析心肌结构形态与纤维化改变。结果显示，NRG2转基因小鼠手术小鼠心室壁增厚程度显著下降，心室腔增大，同时心肌排列紊乱程度和纤维化程度明显比NTG小鼠严重，说明在压力负荷下，转基因表达NRG2缩短了肥厚过程，同时加速了心衰进程 （封底图4）。

3 讨论

NRG2与NRG1基因结构最为相似，其表皮生长因子样结构域即具有和ErbB受体相互作用的功能，它以不同程度的亲和力直接和ErbB2、ErbB4结合，而ErbB2和ErbB4促进神经系统发育及神经肌肉间的连接，对维持心脏的功能具有重要作用［10］。NRG2在成年大鼠中的表达主要分布于肝和肺以及脑组织中的小脑和嗅球；NRG2在小鼠的整个神经系统的发育阶段都有表达，能够促进神经系统发育及神经肌肉间的连接，且在9.5 d小鼠胚胎中主要表达于心脏的心房结构［3，8-9］。NRG2异构体种类多样，其中人的NRG2γ和β具有抵抗血管生成的作用［3］，而NRG2敲除小鼠表现出早期生长发育迟缓，增加刚出生幼崽的死亡率的的情况。这些皆提示NRG2可能参与心脏病生理进程，然而目前尚无关于NRG2在心脏发育及相关心脏疾病调控的研究报道，所以本文建立了心脏组织特异性过表达NRG2转基因小鼠，研究其于心脏发育己心脏疾病调节中的病生理作用［7］。

与NTG小鼠相比，NRG2转基因小鼠LVPWD增加，表明NRG2作为一种生长因子，具有促进心脏发育的作用。NTG小鼠经过TAC手术处理后的LVEDV有微弱的下降，而转基因小鼠经过TAC手术处理后的LVEDV增加。NTG小鼠经过TAC手术处理后的LVPWD增加明显，高达37.0％，而NRG2转基因小鼠LVIDD仅增加8.4％。说明转基因表达NRG2，心脏在压力负荷下的肥厚过程被抑制，而是表现为左心室扩大的病理表型。本文利用的TAC重建小鼠模型是诱导心肌肥厚和心衰的常用方法［13］，其可模拟人类心血管疾病并可用于分析涉及心肌肥厚及心衰过程的相关研究工作，其原理是主动脉经结扎重建后，心脏左室负荷增加，心肌发生代偿性肥厚反应，小鼠最初形成心肌肥厚，但心脏很快失代偿，心室发生扩张并以时间依赖的方式逐渐发展为心衰，同时病理组织学改变与临床表现类似。

结合本文超声及病理组织学分析的结果，在压力负荷，NRG2过表达可使小鼠心脏由代偿期更快进入失代偿期，转基因表达NRG2缩短了肥厚过程，同时加速了心衰进程。

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The establishment of cardiac-specific human Neuregulin-2 transgenic m ice and cardiacfunction analysis

LU Ying-dong，BAO Dan，LIU Ning，ZHANG Xu，MA Yuan-wu，LV Dan，ZHANG Lian-feng
（Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences（CAMS）＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College（PUMC），Beijing 100021，China）

Objective To study the effects of NRG2 on cardiac structure and function，we established the cardiac -specific human NRG2 transgenic mice and investigate the effect of NRG2 on cardiac structure and function under pressure overload situation.M ethods The transgenic vector was constructed by insertion of the human NRG2 gene under theα-MHC promoter.The transgenic mice were generated by microinjection and were all maintained on a C57BL/6J genetic background.The genotype of transgenic mice was identified by PCR and the expression level of target gene wasdetermined by western blot.Transverse aortic constriction（TAC）was applied to prepare the pressure overload induced cardiomyopathymicemodel.The cardiac structure and function of the transgenic mice were compared and analysized by echocardiographic and pathological observation.Results Transgenic mice with high level of NRG2 in heart tissues were established.The left ventricular wall thickness（LVPWD）was increased，and to 15.6％at 3 months old compared with that of the non transgenic（NTG）mice.The hypertrophy of left ventricular wall caused by pressure overload was removed due to the expression of NRG2.Meanwhile，cardiac disarray and fibrosis were increased obviously compared with that of the NTGmice.Conclusion The transgenic expression of NRG2 in heart tissues could shorten the pathological process of hypertrophy，but accelerated the process of heart failure（HF）.

NRG2；Transgene；Pressure overload；Ventricular remodeling

R332

A

1671-7856（2014）03-0078-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.016

国家科技支撑计划课题（2012BA139B02）。

路迎冬（1988年-），女，硕士生，研究方向：比较医学。E-mail：luyd@cnilas.org。

张连峰。E-mail：zhanglf@cnilas.org。

2014-02-20