异氟烷预处理对大鼠肝缺血再灌注时脑线粒体钙及线粒体转运通道的影响

沈 洁，从长慧

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

异氟烷预处理对大鼠肝缺血再灌注时脑线粒体钙及线粒体转运通道的影响

沈 洁，从长慧

（中国医科大学附属盛京医院麻醉科，沈阳 110004）

目的 通过观察在体大鼠肝部分缺血再灌注损伤后脑线粒体游离钙、线粒体转运通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）及外周血中S-100β蛋白含量的变化，明确异氟烷预处理对大鼠肝部分缺血再灌注时脑损伤是否具有保护作用及可能的机制。方法 SD大鼠75只随机分成假手术组（S组）；缺血再灌注组（I/R组）：肝缺血60 min，再灌注120 min；异氟烷预处理组（ISO组）：肝I/R前60 min ISO预处理30 min，后用空气洗脱30 min：CsA+ISO组，CsA50 mg/kg静脉内注射，30 min后同ISO组；CsA组，I/R前30 min CsA50 mg/kg静脉内注射。再灌注24 h迅速断头取前脑，分离线粒体进行线粒体游离钙、MPTP含量检测，各组分别于缺血前及再灌注120 min后抽取静脉血采用双抗体夹心-ELAISA法测定S-100β蛋白含量。结果 I/R组（287.32± 26.17）线粒体游离Ca2+浓度明显增加，高于S组（198.54±21.02）和ISO组（209.74±29.49）（P＜0.05）；CsA+ ISO（267.31±37.52）明显高于ISO组（P＜0.05）；CsA（288.63±23.15）组与I/R组间比较差异无显著意义（P＜0.05）；I/R组（1.73±0.24）的ΔS与S组（2.36±0.35）和ISO组（2.11±0.32）相比明显减少（P ＜0.05），既MPTP大量开放，而后两组的差异无统计学意义（P＜0.05）；I/R组与CsA+ISO组（1.72±0.34）和CsA组（1.77 ±0.35）△S之间差异无统计学意义（P＜0.05）；CsA+ISO组的ΔS值与ISO组相比明显降低（P＜0.05）。外周血液S-100β蛋白I/R组明显高于S组和ISO组（P＜0.05）；CsA+ISO组与ISO组比较显著升高（P＜0.05），I/R组，CsA+ISO组和CsA组与缺血前比较明显升高（P＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五组无显著性差异（P＜0.05）。结论 大鼠肝部分缺血再灌注后对脑组织造成了一定程度损伤，而异氟烷预处理对此损伤具有一定保护作用；其作用的机制可能与异氟烷抑制MPTP开放，降低线粒体游离Ca2+浓度，防止了线粒体Ca2+超载有关。

异氟烷；肝缺血再灌注；脑；大鼠；线粒体钙；线粒体转运通道

脑保护是围术期医学的重要内容，特别是经历手术创伤及全麻后大脑功能会受到怎样的影响越来越受到人们的关注，这就要求我们围术期医生特别是麻醉医生不仅要保证患者生命安全还要最大程度保证手术麻醉后病人脑功能不受影响。虽然围术期脑保护措施有很多种，但通过应用药物使脑组织对损伤不易感的预处理、后处理及同时处理干预是目前已知的围术期治疗的重要干预措施之一［1-3］。笔者前期研究表明吸入麻醉药异氟烷（isoflurane，ISO）预处理对鼠脑及肝直接的缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤具有保护作用，且发现这种作用与抑制线粒体通透性转运通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP），降低线粒体Ca2+超载有关［4］。但临床工作中往往存在某一脏器的直接损伤可能会引起其远隔脏器的损伤。有研究表明血浆和脑脊液中S-100β蛋白含量的变化与神经系统的疾病和损伤有关，当中枢神经系统细胞损伤时S-100β蛋白从胞液中渗出进入脑脊液和（或）经受损的血脑屏障进入血液中，因此S-100β蛋白在血浆中的浓度变化可以反映中枢神经系统损害程度，并已成为判断和评估脑损伤预后的特异性指标［5］。目前，麻醉药物对肝脏手术后远隔器官的保护方面的研究还很少［6-7］。本研究通过观察在体大鼠肝部分缺血再灌注损伤后脑组织线粒体游离钙、MPTP含量检测及外周血中S-100β蛋白含量的变化，探讨大鼠肝部分缺血再灌注后对脑组织是否造成了损伤、异氟烷预处理对其是否具有保护作用，通过应用环孢菌素A（MPTP特异性阻滞药，cycloporin A，CsA）后观察上述指标的变化进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物选择及分组

健康雄性清洁级SD大鼠75只，体重在280～350 g（北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK （京）2009-0004】，实验动物使用合格证号：【SYXK （辽）2010-0008】，分5组每组15只。假手术组（S组），缺血再灌注组（I/R组），异氟烷预处理组（ISO组），CsA+ISO组和CsA组

1.2 实验方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作建立大鼠肝缺血再灌注模型［8］，10％水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉后固定于实验台上，气管切开，连接小动物呼吸机，左颈内静脉穿刺，持续输注乳酸钠林格氏液7 mL/kg·h，水合氯醛持续泵入，维持麻醉状态，采用腹部弧形切口，充分显露第一肝门部，入腹后分离肝十二指肠韧带，分离胆总管，应用无创动脉夹阻断肝左叶及中叶血流，造成70％肝脏缺血，但不阻断右叶肝血流，60 min后松开动脉夹，再灌注120 min。整个实验过程利用灯泡加热，使直肠温保持在36.7℃ ～37.3℃。

1.2.2 异氟烷预处理 将鼠吸入异氟烷，使异氟烷的 肺 泡 最 低 有 效 浓 度 （minimal alveolar concentration，MAC）维持在1.0 MAC，（Datex气体监测仪监测）。

1.2.3 分组

S组：入腹后只分离肝十二指肠韧带，但不阻断肝门血供；

I/R组：肝缺血60 min，再灌注120 min；

ISO组：肝I/R前60 min ISO（雅培公司）预处理30 min，后用空气洗脱30 min；

CsA+ISO组：CsA（sigma公司）50 mg/kg静脉内注射，30 min后同ISO组；

CsA组：I/R前30 min CsA 50 mg/kg静脉内注射。

1.2.4 取材及检测

再灌注24 h迅速断头取前脑，置于冰块上并用冰生理盐水冲洗，采用低温（0℃ ～4℃）差异离心法分离前脑线粒体，用分离介质（0.25 mol/L蔗糖、0.0001 mol/L EDTA-2Na、0.005 mol/L的Tris-HCl、0.8％NaCl，pH=7.4）制备线粒体悬浮液。取出少许悬浮液，用中性红-詹纳斯绿B染色后，在高倍显微镜下观察，被染成亮绿色颗粒即线粒体。

MPTP开放程度的测定 用1601型紫外分光光度计（岛津公司，日本）在540 nm波长处记录每分钟吸光度的变化，平衡后的吸光度变化值（△S）反映 MPTP开放的程度，△S越小，代表MPTP开放的程度越大，线粒体蛋白浓度为0.5 mg/m L。

线粒体游离Ca2+浓度的测定 根据文献［9］介绍的方法略加改进。以Fura-2/AM（Sigma公司，美国）为Ca2+荧光指示剂，用850型荧光分光光度计（Hitachi公司，日本）测定线粒体游离Ca2+浓度，发射波长510 nm，以430 nm激发光谱扫描。根据实测荧光值（F）、最大（Fmax）及最小（Fmin）荧光强度比值计算出 Ca2+浓度，［Ca2+］i =Kd{（F-Fmin）/（Fmax-F）}，Kd为荧光指示剂的介电常数，Fura-2=224 nmol/L，（单位为nmol/mg·L）。

各组分别于缺血前及再灌注120 min后抽取静脉血2 mL，静置15 min后，3000 r/min离心20 min，取血清-80℃冰箱保存，测定S-100β蛋白含量，采用双抗体夹心-ELAISA法检测（购自大连生物科技有限公司），按说明书操作。

1.3 统计学处理

所有计量数据用SPSS12.0软件进行统计学处理，以（¯±s）表示，组间差异比较采用单因素方差（One-Way ANOVE）分析，LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体Ca2+浓度的变化

I/R组Ca2+浓度（287.32±26.17）明显高于S组（198.54±21.02）和ISO组（209.74±29.49）（P＜0.05）；ISO组Ca2+浓度高于S组，但差异无显著意义（P ＞ 0.05）；而 CsA+ISO组 Ca2+浓度（267.31±37.52）明显高于 ISO组（P ＜0.05）；CsA组（288.63±23.15）与I/R组间差异无显著意义（表1）。

2.2 MPTP开放程度（△S）的变化

与I/R组（1.73±0.24）相比，S组（2.36± 0.35）和ISO组（2.11±0.32）的△S明显增加（P＜0.05），而后两组的差异无统计学意义（P＞0.05）；I/R组与 CsA+ISO组（1.72±0.34）和 CsA组（1.77±0.35）△S之间差异无统计学意义（P ＞0.05）；CsA+ISO组的△S值与ISO组相比明显降低（P＜0.05）（表1）。

2.3 外周血中S-100β蛋白含量的变化

再灌注后，I/R组S-100β蛋白含量显著高于S组（P＜0.05）；ISO组与I/R组相比S-100β含量明显下降（P＜0.05），CsA+ISO组和CsA组与S组比较显著升高（P＜0.05），与ISO组比较也升高显著（P＜0.05），I/R组，CsA+ISO组和CsA组与缺血前比较明显升高（P ＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五组无显著性差异（P＞0.05）。

表2 S-100β蛋白含量的变化Tab.2 The contents of S-100βprotein in serum

3 讨论

临床工作中往往存在某一脏器的直接损伤也可引起其远隔脏器（如脑组织）的损伤，这些均与脑灌注减少脑供血供氧失衡有关，血脑屏障及血管壁的破坏使脑缺血加重，自由基的急剧增加、脑微循环的病生理改变是再损伤的基础［10-11］。肝缺血再灌注损伤不仅可以造成肝脏局部的损害，同时激活网状内皮系统释放大量的细胞因子、蛋白水解酶，氧自由基和氧化氮等进入血液循环到达远隔器官如心、脑、肾等，损害这些脏器。S-100蛋白是一种高度酸性的钙结合蛋白，根据其亚单位结构可分为S-100αα（S-100αo）、S-100αβ（S-100α）、S-100ββ （S-100β）三种。在生理情况下，其中S-100ββ蛋白特异地存在于中枢神经胶质细胞，星形细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞及大胶质细胞中。因此，S-100β蛋白被认为是神经胶质的标记蛋白，是脑特异蛋白［12］。缺血性疾病急性期血清和脑脊液中的S-100β蛋白升高显著，主要原因是由于神经胶质细胞坏死后S-100β蛋白的释放和血脑屏障受损后通透性的增高，S-100β蛋白在脑脊液和外周血中的浓度反映中枢神经受损害的程度，故作为中枢神经系统疾病的生化标记物［13-14］。本实验中I/R组缺血再灌注120 min后外周血液S-100β蛋白显著高于对照组，说明大鼠肝的损害造成了鼠脑细胞的损伤和血脑屏障的破坏。ISO组虽然与缺血前比较S-100β蛋白有一定升高，但与I/R组比较显著下降，表明异氟烷预处理对鼠脑起到了一定保护作用，而CsA+ ISO组和CsA组外周血液S-100β蛋白的增加与I/R组基本一样，说明异氟烷预处理对鼠脑的保护作用一定程度上受到的抑制与CsA有关，而单纯应用CsA后外周血液S-100β蛋白并未有变化。

肝脏I/R损伤的发病机制十分复杂，其中钙离子超载和MPTP开放是一个重要的原因［15-16］。正常情况下，神经元膜内外存在着极大的钙离子电化学梯度，细胞的调控作用是细胞质Ca2+维持在0.1～1.01 umol/L，而细胞外Ca2+则高达上万倍约1.5 mmol/L，脑损伤后脑缺血再灌注可导致脑内高能磷酸物质快速消耗，不足以维持细胞内外的正常离子梯度。从而使电压依赖调控的钙通道开放，造成严重的钙稳态失衡，细胞内钙超载，当超过线粒体缓冲浓度范围时，产生线粒体钙超载，Ca2+增加可激发胞质和胞核的一系列反应造成组织损伤。线粒体通透性转运通道是一种由线粒体内膜和外膜跨膜蛋白共同构成的高电导非选择性通道。其分子组成尚不完全清楚，许多证据表明它可能是由腺苷酸转移酶（translocase of adenine nucleotides，ANT）、电压依赖性阴离子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）和亲环素D（cyclophilin D，CyP-D）组成的［17-18］。正常情况下MPTP复合体仅允许相对分子量小于1.5×103的化合物通过，因此，它有维持线粒体基质和胞质之间渗透压梯度的作用，致使高分子量化合物在线粒体基质内的浓度高于在线粒体膜间隙和胞质的浓度。许多因素如Ca2+、自由基或膜电位降低都可触发MPTP开放，选择性释放细胞色素 C及凋亡诱导因子（apotosis inducing factor，AIF）等物质，提示MPTP开放可能是导致细胞凋亡的机制之一。我们利用MPTP增大时线粒体膜内外渗透失衡，导致吸光度明显减少的原理，检测了各组MPTP开放程度，发现肝I/R损伤后脑线粒体MPTP大量开放，同时脑组织线粒体游离Ca2+浓度明显增加，这可能是线粒体自身调节Ca2+稳态的不良后果，而Ca2+浓度增加又可诱发MPTP开放，产生正反馈的恶性循环，这与Kobayashi的研究［19］结果一致；表明肝缺血60 min，再灌注120 min后对脑产生了明显的损伤；而大鼠吸入麻醉药ISO进行预处理后再进行肝I/R线粒体游离Ca2+浓度明显降低，异氟烷预处理防止了线粒体Ca2+超载，起到了一定脑保护作用；另外，发现进行ISO预处理后鼠脑的MPTP的开放受到明显抑制，MPTP受到抑制后使线粒体游离Ca2+浓度降低，而Ca2+浓度降低又可抑制MPTP的开放，因此减轻了I/R对鼠脑的损伤，表明ISO预处理作用可能是通过抑制MPTP开放介导的。而Ca2+又是MPTP开放的主要诱发因子，过量的Ca2+超过线粒体自身的承受限度时，则促使MPTP开放，使线粒体基质代谢物丧失，膜电势消失，ATP耗竭，线粒体肿胀，造成细胞损伤［17］。Kobayashi等人［19］的研究显示应用环孢菌素A后可以减轻海马CA1的迟发性细胞损伤，证明MPTP与迟发性神经损伤有关，并且是I/R所致脑细胞损伤的关键部位。所以，减少线粒体 Ca2+超载，抑制MPTP的开放，维持线粒体形态及功能正常，某种程度上可能防止脑神经细胞死亡，起到脑保护作用。本实验中我们也设立了CsA组（药物空白对照），其线粒体游离Ca2+浓度和MPTP结果与I/R组比较均没有显著性差异，说明特异性MPTP阻滞剂CsA本身对大鼠脑损伤没有明显作用；同时我们又对鼠进行ISO预处理前采用CsA静脉注射干预后，发现线粒体游离Ca2+浓度明显增加，MPTP大量开放，逆转了ISO预处理使线粒体游离Ca2+浓度降低及抑制MPTP开放作用，取消了ISO预处理的脑保护作用，进一步证明ISO预处理作用机制可能是与抑制MPTP开放有关。

CsA是临床应用的一种免疫抑制剂，且有一定肝毒性。有研究发现CsA对细胞凋亡有一定调节作用，既有抑制细胞凋亡作用也有诱导细胞凋亡作用［20］。CsA与 CyclophilinD组成复合体来抑制MPTP的开放，而我们前期研究发现异氟烷脑保护作用与抑制MPTP的开放有关，那么异氟烷与CsA是否有相同作用部位，从而取消了异氟烷脑保护作用，这有待于进一步研究。我们设立了CsA组，从线粒体钙水平的检测看并未有明确的细胞损伤，也没有显示有细胞保护作用，这可能与动物模型或使用剂量有关。此研究我们没有进行相关凋亡因子的检测，另外肝缺血再灌注损伤所造成的脑组织一定程度损伤的具体机制及可能的信号传导也没有进行研究，这有待于今后进一步研究探讨。

本研究通过观察在体大鼠肝部分缺血再灌注损伤后外周血S-100β蛋白含量的变化，结合脑组织线粒体游离钙和线粒体通透性转运通道的变化，明确大鼠肝部分缺血再灌注后对鼠脑造成了损伤，而异氟烷预处理对此损伤具有一定保护作用；并且通过应用特异性MPTP阻滞剂CsA干扰后，进一步探讨了其作用的机制可能与抑制MPTP开放，降低线粒体游离Ca2+浓度，防止了线粒体Ca2+超载有关。

［1］Johnsen D，Murphy SJ.Isoflurane preconditioning protects neurons from male and female mice against oxygen and glucose deprivation and is modulated by estradiol only in neurons from femalemice［J］.Neuroscience，2011，9（1）：53-60.

［2］Kitakaze M.How tomediate cardioprotection in ischemic heartsaccumulated evidence of basic research should translate to clinical medicine［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24（2）：217-223.

［3］Adamczyk S，Robin E，Simerabet M，et al.Sevoflurane pre-and post-conditioning protect the brain via the mitochondrial KATPchannel［J］.British Journal of Anaesthesia，2010，104（2）：191 -200.

［4］刘东俊，吕金，陈华，等.异氟烷预处理对大鼠肝部分缺血再灌注时脑的保护作用［J］.中国医师杂志，2013，15（1）：25-28.

［5］Kanner AA，Marchi N，Fazio V，et al.Serum S-100beta：a noninvasive marker of blood-brain barrier function and brain lesion［J］.Cancer，2003，97（11）：2806-2813.

［6］Minjae K，Sang WP，Mihwa K，et al.Isoflurane activates intestinal sphingosine kinase to protect against renal ischemiareperfusion-induced liver and intestine injury ［J］.Anesthesiology，2011，114（2）：363-373.

［7］Nasser AT，Mohammed MH，Khulood AF，etal.Traumatic brain injury：neuroprotective anaesthetic techniques，an update［J］.Injury，Int.J.Care Injured，2009，40（4）：75-81.

［8］Martins PN，Neuhaus P.Surgical anatomy of the liver，hepatic vasculature and bile ducts in the rat［J］.Liver Int，2007，27（3）：384-392.

［9］Mccormack JG， Browne HM， Dawes NJ.Studies on mitochondrial Ca2+transportandmatrix Ca2+using fura-2-loaded rat heartmitochondria［J］.Biochim Biophys Acta，1989，97（3）：420-427.

［10］李少清，范廷君，马建国.脑损伤的脑保护探讨［J］.中国实用神经疾病杂志，2007，10（3）：160-161.

［11］王士雷，刘志林.线粒体钙单向转运体在远距预处理脑保护中的作用及其机制［J］.山东医药，2011，51（39）：9-11.

［12］Donate R.Functional roles of S-100 proteins，calcium-birding proteins of the EF-hand type［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1450（3）：191-231.

［13］Miqsler U.S-100 protein and neuronspecific enolase concentration in blood as indication of infaretion volume and prognosis in acule ischemie stroke［J］.Stroke，1997，28：1956-1960.

［14］许赞峰.S-100β蛋白与中枢神经系统损伤的研究进展［J］.中国微侵袭神经外科杂志，2004，9（12）：573-575.

［15］Li L，Zuo Z.Isoflurane postconditioning induces neuroprotction via akt activation and attenuation of increased mitochondrialmembrane permeability［J］.Neuroscience，2011，10（1）：22-28.

［16］葛廷，王小琦，廖世奇，等.肝缺血再灌在损伤机制及相关细胞因子关系的研究进展［J］.甘肃医药，2010，29（5）：499 -503.

［17］Javadov S， Karmazyn M， Escobales N.Mitochondrial Permeability Transition Pore Opening as a PromisingTherapeutic Target in Cardiac Diseases［J］.JPharmacol Exp Ther，2009，330 （3）：670-678.

［18］Akopova OV.The role of mitochondrial permeability transition pore in transmembrane Ca2+-exchange in mitochondria［J］.Ukr Biokhim Zh，2008，80（3）：40-47.

［19］Kobayashi T.The roles ofmitochondrial permeability transition in brain ischemia［J］.Hokkaido Igaku Zassi，2000，75（4）：243 -252.

［20］曾赟.环孢菌素A在细胞凋亡中的作用［J］.南京铁道医学院学报，2001，20（2）：137-139.

Preconditioning effect of isoflurane on m itochondria free calcium concentrate and m itochondria permeability transition pore after liver ischem ia-reperfusion injury in rat brain

SHEN Jie，CONG Chang-hui
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the protective effect and themechanism of isoflurane preconditioning on rat brain tissue suffering from rat liver ischemia-reperfusion injury.Methods 75 SD rats were randomly divided into five groups，sham group（S group）；ischemia-reperfusion group（I/R group）：liver ischemia for 60 min，reperfusion for 120min；isoflurane preconditioning group（ISO group）：60 min before liver I/R，ISO pretreatment for 30 min；CsA+ISO group；CsA（MPTP specific blocker）50 mg/kg intravenous injection，the same as ISO group after 30 min；CsA group：CsA 50 mg/kg intravenous injection.30 min before I/R.The animals were killed 24 h after ischemia and their brain were excised formeasurement ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）and calcium content in mitochondria.The measurement of content of S-100βprotein in serum before ischemia and 120min after reperfusion through the application of Elisa kit.Results Themitochondrial Ca2+concentration of I/R group（287.32±26.17）was higher than that in S group （198.54±21.02）and the ISO group（209.74±29.49）（P ＜0.05），and Ca2+concentration of CsA+ISO group （267.31±37.52）was higher than the ISO group（P＜0.05）；therewas not statistical significance between I/R and CsA group（288.63±23.15）（P ＜0.05）.MPTP were more opened in I/R group（△S：1.73±0.24）than that in S group （△S：2.36±0.35）and ISO group（△S：2.11±0.32）（P＜0.05），butMPTPweremore opened in CsA+ISO group than that in ISO group（P ＜0.05）.The content of S-100βprotein in serum was significantly higher in I/R group than that in sham and ISO groups（P＜0.05），and the contentof S-100βprotein in serum was significantly higher in CsA+ISO group than in the ISO groups（P ＜0.05）.Conclusion The liver ischemia-reperfusion may injury the brain of the rat and isoflurane preconditioning can protect the brain on the rat.The reduce ofmitochondria calcium overload and inhibition of MPTP opening are involved in themechanism.

Isoflurane；Liver ischemia-reperfusion； Brain； Rat； Mitochondria calcium；Mitochondrial permeability transition pore

R971.2 R332

A

1671-7856（2014）03-0025-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.006

辽宁省教育厅课题项目（2008792）。

沈洁（1963-），硕士生导师，博士，副教授。研究方向：麻醉药物与器官保护。E-mail：Shenjie-63@163.com。

2014-02-11

研究报告