超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱和超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱用于血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷的定性和定量分析

高 萌， 王跃生， 魏惠珍， 欧阳辉， 何明珍，曾恋情， 申峰云， 郭 强， 饶 毅＊

（1.江西中医药大学，江西 南昌330004；2.中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌330006；3.中国中医科学院中药研究所，北京100700）

麻杏石甘汤最早见于汉代张仲景所著《伤寒论》一书，由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草4味药材组成。具有辛凉宣泄，清肺平喘功效。其中苦杏仁为常用止咳平喘药，有小毒，归肺、大肠经［1］。苦杏仁中的有效成分是苦杏仁苷（amygdalin，结构式见图1）。苦杏仁苷为医药上常用的祛痰止咳剂、辅助性抗癌药［2］，苦杏仁含有苦杏仁苷约2.4%，苦杏仁苷受杏仁中的苦杏仁酶及樱叶酶等水解，依次生成野黑樱苷（prunasin，结构式见图1）和扁桃腈，再分解生成苯甲酸和氢氰酸［3］。

近年来对于复杂成分的定性和定量分析，尤其是人或动物体液中微量成分的测定方面，液相色谱－质谱联用作为一种高效互补的分离鉴定技术，具有灵敏度高、结果准确等特点而得到广泛应用［4－6］。根据文献报道［7－11］，目前采用液相色谱－质谱联用技术对大鼠体内苦杏仁苷的研究存在定量限较高，样品处理复杂，且在口服药物后未能检测到苦杏仁苷原型的问题，而对苦杏仁苷代谢产物仅有定性分析。另据报道，对大鼠进行苦杏仁生品水煎液灌胃给药和苦杏仁苷注射给药，结果显示苦杏仁苷注射给药后在血浆样品中可检测到苦杏仁苷原型，而灌胃给药后则未检测到原型，只能检测到其代谢产物野黑樱苷［12－14］。本研究首先采用液相色谱－四极杆飞行时间质谱（UPLC－QTOF－MS／MS）联用技术，根据精确质量数测定及MS／MS分析大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品，检测到了代谢产物野黑樱苷及苦杏仁苷原型，同时使用液相色谱－三重四极杆质谱联用仪（UPLC－Q－TRAP－MS）对待测物进行定量分析，为探讨麻杏石甘汤中苦杏仁活性成分的体内变化过程提供科学参考。

图1 苦杏仁苷和野黑樱苷的结构式Fig.1 Structures of amygdalin and prunasin

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：岛津LC－30A液相色谱－AB Triple TOF 5600四极杆飞行时间质谱联用仪（数据采集Analyst TF 1.6 ABsciex；数据分析Peak View software Version 1.2.0.3）；岛津 LC－30A 液相色谱－AB QTRAP4500三重四极杆质谱联用仪（数据采集Analyst 1.6.1 ABsciex）；万分之一天平（AB104－N，梅特勒－托利多）；十万分之一天平（岛津AUW2200电子分析天平）；超声波清洗仪（KQ－250DB，昆山市超声仪器有限公司）；Milli－Q超纯水仪（美国 Millipore公司）；台式离心机：TGL－16C（上海安亭科学仪器厂）；涡旋仪：IKA Vortex Genius 3；低温保存箱：DW－40L262（青岛海尔特种电器有限责任公司）。

对照品：苦杏仁苷对照品购自中国药品生物制品检定所（批号110820－201004）；野黑樱苷对照品购自碧伊（上海）化学科技有限公司（批号BBP02178）；氯霉素（chloramphenicol，内标）对照品购自中国药品生物制品检定所（批号130303－200614）。

试剂：甲酸、甲酸铵（Sigma公司）；乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷（分析纯，上海实验试剂有限公司）；水：娃哈哈纯净水，经Millipore超纯水仪过滤；HPLC级甲醇、乙腈（Fisher公司）。

饮片：生麻黄（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号812018）、炙甘草（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号1003035）、制苦杏仁（江中（武宁）中药饮片有限公司，批号120130）、生石膏（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号908089）。

动物：清洁级SD大鼠，雄性，体重为（220±20）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号SCXK（湘）2011－0003。

1.2 实验步骤

1.2.1 标准储备溶液和工作溶液的配制

精密称取苦杏仁苷、野黑樱苷和氯霉素对照品适量置于25 mL容量瓶中，用甲醇配制成质量浓度分别为84.0、99.6和12.4 mg／L 的标准储备液，4℃冷藏，备用。

分别吸取不同体积的苦杏仁苷标准储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度为 4 200、2 100、1 050、525.00、105.00、52.50、10.50、5.25、1.05 和 0.53 ng／mL的系列标准溶液；分别吸取不同体积的野黑樱苷标准储备液，用甲醇逐级稀释成质量浓度为2 490、1 245、622.50、249.00、124.50、24.90、12.45、6.23、1.25和0.62 ng／mL 的系列标准溶液。

分别吸取苦杏仁苷和野黑樱苷标准储备液各10 mL置于20 mL容量瓶中混合，用甲醇逐级稀释成系列混合标准溶液，其中苦杏仁苷质量浓度分别为 4 200、2 100、1 050、525.00、105.00、52.50、10.50、5.25、1.05和0.53 ng／mL；野黑樱苷质量浓度 分 别 为 2 490、1 245、622.50、249.00、124.50、12.45、6.23、1.25和0.62 ng／mL。

1.2.2 麻杏石甘汤药液的煎煮

按麻杏石甘汤处方比例（麻黄、杏仁、石膏和甘草质量比为6∶6∶24∶6）取各味饮片，先称取麻黄药材、石膏药材，加入方药总质量的8倍水，称重，计算煎煮前的总重。加热至沸腾，然后改用小火煎煮30 min，再加入甘草、苦杏仁煎煮40 min，补重，趁热过滤，即得麻杏石甘汤汤剂，于80℃旋转浓缩至1 g／mL药液。密封后－20℃储存，备用。

1.2.3 给药与样品采集

健康SD大鼠，雌雄各半，实验前12 h禁食不禁水，灌胃1.2.2项下制得的麻杏石甘汤药液，连续7天，在末次给药1 h后，大鼠心脏取血至含肝素钠的EP离心管中，立即离心3 000 r／min×10 min后取上层血浆分装，置于－40℃冰箱中冰冻待测。

1.2.4 血浆样品处理

精密吸取100μL血浆，加入30μL内标溶液，加入1 mL的乙酸乙酯，涡旋混合提取5 min，离心5 000 r／min×5 min，将有机层转移至另一离心管中，再加入1 mL的乙酸乙酯与水层涡旋混合提取5 min，离心 5 000 r／min×5 min，合并两次乙酸乙酯液，合并液用N2在40℃下吹干，残渣用100μL甲醇溶解，涡旋5 min，离心 15 000 r／min×5 min，取上清液，待测。

1.3 仪器分析条件

1.3.1 色谱条件

定性色谱条件：Shim－pack XR－ODSⅢ（75 mm×2.0 mm，1.6μm）；柱温40℃；进样量5μL；流速0.25 mL／min；流动相 A 为0.1%（v／v）甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序：0～1.5 min，1%B；1.5～7.0 min，1%B～10%B；7.0～10.0 min，10%B～20%B；10.0～15.0 min，20%B～90%B；15.0～17.0 min，90%B；17.1～20.0 min，1%B。

定量色谱条件：Agilent C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱 温 40 ℃；进 样 量 2μL；流 速 0.3 mL／min；流动相 A为0.1%（v／v）甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～0.05 min，1%B；0.05～1.70 min，1%B～63%B；1.70～2.00 min，63%B～90%B；2.00～3.00 min，90%B；3.01～4.00 min，1%B。

1.3.2 质谱条件

定性条件：AB Triple TOF 5600四极杆飞行时间质谱仪采用电喷雾离子化（ESI）源，喷雾电压（IS）：－4 500 V，离子化温度（TEM）：600℃；雾化气（GS1）：413 685 Pa；辅助加热气（GS2）：482 633 Pa；气帘气（CUR）：206 843 Pa；碰撞气（CAD）：Medium；扫描模式：Negative。一级质谱采集范围为m／z 100～800，累积时间200 ms，二级质谱采集范围为m／z 90～800，累积时间100 ms，碰撞能量（CE）40 eV；碰撞能量叠加（CES）15。

定量条件：AB Q－TRAP 4500三重四极杆质谱仪采用ESI源，多反应监测（MRM）模式测定；喷雾电压（IS）：－4 500 V，离子化温度（TEM）：600℃；雾化气（GS1）：413 685 Pa；辅助加热气（GS2）：482 633 Pa；气帘气（CUR）：206 843 Pa；碰撞气（CAD）：Medium；优化的各离子对质谱参数值见表1。

表1 MS／MS定量分析参数Table 1 Parameters for MS／MS quantitative analysis

2 结果与讨论

2.1 定性方法的建立与优化

野黑樱苷（分子式为C14H17NO6）为苦杏仁苷（分子式为C20H27NO11）脱去一分子糖而得，均含有N原子，因此首先对其选择正离子扫描进行分析。在前期实验中，采用超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪在正离子模式下对待测物分析，未发现野黑樱苷［M＋H］＋峰。在m／z 318附近有一未知物，初步推断可能为野黑樱苷［M＋Na］＋峰，但进一步分析该化合物发现其二级质谱与野黑樱苷无相关性，可能为一未知干扰物。为验证结果，使用了超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪对未知物和野黑樱苷及苦杏仁苷进行分析，通过提取精确相对分子质量，拟合元素组成，偏差小于5 ppm，苦杏仁苷一级质谱图中显示 m／z为 480.146 7（图2 a1），推测为［M＋Na］＋分子离子峰，二级质谱图中信号最强的m／z为 347.095 3（图2 a2），推测为母离子脱去中性碎片扁桃腈（C8H7NO），野黑樱苷一级质谱图（图2 b1）中显示m／z为 318.094 0，推测为［M＋Na］＋分子离子峰，同时图中存在一个与野黑樱苷母离子精确质量数（m／z 318.094 0）相近的质量数（m／z 318.307 6）。这两个精确质量数在四极杆飞行时间质谱中可以分辨，但是在分辨率低的三重四极杆质谱中难以区分，因此对此未知干扰物进行了二级质谱确证，图2 b2为野黑樱苷和未知干扰物的二级质谱碎片信息。野黑樱苷母离子（m／z 318.095 4）和干扰物母离子（m／z 318.301 5）的子离 子 为 m／z 256.263 9、185.042 7、88.076 5。 通过对子离子拟合分子式，得知子离子不是野黑樱苷的子离子，可能为未知物的子离子，并对野黑樱苷产生干扰；改变碰撞能量，干扰离子一直存在，对大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品处理并进行质谱分析，同样存在未知物干扰，且信号强度远大于待测物，干扰仪器测定。通过对对照品及血浆样品在该模式下进行质谱分析，结果均存在未知物干扰，因此在采用三重四极杆质谱仪定量分析时要避免采用未知物的子离子为定量离子对。

图2 苦杏仁苷在正离子条件下的（a1）一级谱图、（a2）二级谱图及野黑樱苷在正离子条件下的（b1）一级谱图、（b2）二级谱图Fig.2 （a1）MS spectrum and（a2）MS／MS spectrum of amygdalin and（b1）MS spectrum and（b2）MS／MS spectrum of prunasin in positive ion mode

苦杏仁苷在液相色谱电喷雾电离质谱联用技术的正负离子模式下有良好的信号响应［15］。选择负离子模式进行监测，通过母离子扫描获得一级质谱图，均找到［M＋HCOO］－分子离子峰，苦杏仁苷和野黑樱苷的母离子分别是m／z 502.157 1 和m／z 340.104 3。在负离子条件下，野黑樱苷响应值较高，母离子精确质量数周围未发现干扰离子，有利于其检测。在选定母离子后，进行子离子扫描获得二级质谱图，苦杏仁苷的主要特征碎片离子为m／z 323.097 7，野黑樱苷的主要特征碎片离子为m／z 161.044 4，通过对特征碎片离子拟合元素组成，偏差小于5 ppm，分析为母离子脱去C8H8NO－碎片离子产生，结果见图3。使用超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪在负离子模式对大鼠灌胃麻杏石甘汤后的血浆样品定性分析，确认苦杏仁苷原型和代谢产物野黑樱苷的存在，并且无干扰物影响野黑樱苷的测定。

图3 苦杏仁苷在负离子条件下的（a1）一级谱图、（a2）二级谱图及野黑樱苷在负离子条件下的（b1）一级谱图、（b2）二级谱图Fig.3 （a1）MS spectrum and（a2）MS／MS spectrum of amygdalin and（b1）MS spectrum and（b2）MS／MS spectrum of prunasin in negative ion mode

2.2 定量方法的建立与优化

质谱监测采用LC－QTOF－MS／MS定性分析时负离子模式下的离子对。在优化色谱条件时考察了不同流动相体系（乙腈－甲酸水溶液和乙腈－水溶液）下待测物质的响应，结果显示在水相中添加适量甲酸有助于待测物质电离，信号强度明显提高。因此，本实验采用乙腈－0.1%（v／v）甲酸水溶液作为流动相，获得了最佳质谱灵敏度。

2.3 样品前处理方法的选择与优化

血浆样品基质较为复杂，用有机溶剂（甲醇、乙腈）沉淀蛋白法处理样品，内源性物质干扰较大，提取回收率低于液－液萃取法。本研究采用液－液萃取法对样品进行处理。考察了不同萃取溶剂（乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙醚、二氯甲烷）、萃取次数及不同体积萃取溶剂等因素对回收率的影响。结果见表2，以乙酸乙酯作为萃取溶剂时，2 mL萃取溶剂分两次萃取，可获得较高的灵敏度和回收率，适用于体内微量成分的定量。

表2 采用不同方式、不同溶剂处理大鼠血浆样品时苦杏仁苷及野黑樱苷的回收率Table 2 Recoveries of amygdalin and prunasin in rat plasma with different methods and different solvents

2.4 定量方法的验证

2.4.1 方法专属性

分别取大鼠空白血浆6份，加入苦杏仁苷和野黑樱苷的混合对照品溶液及灌胃麻杏石甘汤后的含药血浆，按1.2.4项下方法处理，分别进样测定。色谱图见图4，在上述定量色谱及质谱条件下，4 min内可测得大鼠血浆中苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，血浆中内源性成分不干扰目标组分的测定。本方法分析速度快、专属性高。

2.4.2 定量限、检出限和方法的线性范围

取1.2.1项下用甲醇配制好的10个不同浓度的混合对照品溶液各100μL，分别加入至空白血浆中并按1.2.4项下方法处理，分别进样2μL，以血浆中各成分的质量浓度X为横坐标，以待测物与内标物的峰面积比值Y 为纵坐标，用加权（W＝1／X2）最小二乘法进行回归，得各化合物在相应浓度范围内的线性方程、线性相关系数（r）、定量限（LOQ，S／N≥10）和检出限（LOD，S／N＝3），结果见表3。

图4 （a）空白大鼠血浆、（b）空白大鼠血浆添加苦杏仁苷、野黑樱苷、氯霉素和（c）大鼠灌胃麻杏石甘汤后血浆样品的提取离子色谱图Fig.4 Extracted ion chromatograms of amygdalin，prunasin and chloramphenicol in（a）blank rat plasma，（b）blank plasma spiked with amygdalin，prunasin and chloramphenicol，（c）plasma sample obtained60 min after intragastric（ig）administration of Maxing shigan decoction

表3 苦杏仁苷和野黑樱苷的线性范围、线性方程、相关系数、定量限和检出限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r），LOQs，LODs of amygdalin and prunasin

2.4.3 精密度、回收率和基质效应

在空白血浆中分别添加高、中、低3个水平的对照品溶液，每个水平5份，按1.2.4项下方法处理，苦杏仁苷和野黑樱苷的平均回收率为82.33%～95.25%，日内RSD和日间RSD分别为3.22%～7.89%和5.73%～9.19%。按1.2.4项下方法处理6种不同来源空白血浆各100μL，在处理后的空白样本中加入高、中、低3个浓度混合对照品溶液与内标溶液，进样分析，比较其与同浓度的对照品溶液响应值，计算基质效应。结果见表4。

表4 苦杏仁苷和野黑樱苷在不同添加浓度下的回收率、精密度和基质效应Table 4 Recoveries，precisions and effects of matrix of amygdalin and prunasin at different spiked levels

2.4.4 稳定性试验

配制标准血浆样品并测定，考察待测物在各种实验条件下的稳定性。在空白血浆中分别添加高、中、低3个水平的待测物标准溶液，按1.2.4项下方法处理，处理后在23℃下2 h内重复进样；4℃下24 h内重复进样；标准血浆样品经－40℃反复冻融3次后测定；标准血浆样品经－40℃条件下贮存30天，考察样品的长期稳定性。结果见表5，含苦杏仁苷、野黑樱苷的血浆样品在23℃条件下放置2 h，4℃条件下放置24 h，－40℃反复冻融3次及－40℃冰冻条件下放置30天条件下各成分的稳定性均良好，能满足测定要求。

表5 苦杏仁苷和野黑樱苷在不同添加浓度下的稳定性Table 5 Stability of amygdalin and prunasin at different spiked levels

2.5 血浆中苦杏仁苷及野黑樱苷的含量测定与分析

研究证实，麻杏石甘汤具有提高动物免疫能力、抗菌、抗过敏［16，17］等作用，能有效抑制咳嗽的产生。“随证施量”是中医临床应用中主要的诊疗模式，随证施量是依据临床症状，改变药物用量，以达到增强疗效的作用。麻杏石甘汤在用于治疗咳嗽等病症时，主要通过改变苦杏仁用量来调整疗效。

实验建立了枸橼酸所致大鼠咳嗽模型，研究在此模型下麻杏石甘汤治疗咳嗽的作用效果，通过改变麻杏石甘汤中苦杏仁剂量，探索苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度的量效关系。为后期研究苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度及治疗效应间的量效关系提供数据参考。实验在原方的基础上，苦杏仁剂量逐渐递减、逐渐递增1.5倍7个剂量组，其他药材剂量不变，另设模型组、阳性组（可待因组）、空白组（见表6），按1.2.2项下方法煎煮，按文献［18］换算成相应的大鼠灌胃剂量，每组灌胃8只大鼠，按1.2.3项下方法给药后取血浆，按1.2.4项下方法处理并测定。血浆中待测成分的血药浓度随麻杏石甘汤中苦杏仁剂量变化趋势见图5，大鼠灌胃麻杏石甘汤，血浆样品中可同时测到苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，随着给药剂量逐级增加，体内苦杏仁苷及野黑樱苷含量呈增加趋势，麻杏石甘汤中苦杏仁剂量在1.19～13.50 g的变化范围内，苦杏仁剂量与苦杏仁苷、野黑樱苷血药浓度存在正相关性。

表6 麻杏石甘汤中苦杏仁剂量的改变致大鼠血浆中苦杏仁苷、野黑樱苷浓度的变化（n＝8）Table 6 Different dosages of almond in Maxing shigan decoction lead to the plasma concentrationchanges of amygdalin and prunasin in rat（n＝8）

图5 血浆中苦杏仁苷和野黑樱苷血药浓度随麻杏石甘汤中苦杏仁剂量变化趋势图Fig.5 Change trend of plasma concentration of amygdalin and prunasin in rat as dose changes of almond in Maxing shigan decoction

3 结论

本研究通过超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪测定精确相对分子质量，快速准确定性苦杏仁苷和野黑樱苷，排除未知物干扰，避免假阳性结果。同时使用超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪对待测物定量分析，仪器灵敏度高，方法前处理简单，定量限约为1 ng／mL，分析过程时间短，仅需4 min，有利于血浆样品中待测成分的测定，为研究血浆中苦杏仁苷、野黑樱苷浓度与麻杏石甘汤中苦杏仁剂量的相关性研究提供技术支持。结果显示在枸橼酸所致大鼠咳嗽模型中，大鼠灌胃麻杏石甘汤，汤剂中苦杏仁剂量从1.19 g增加到13.50 g时，血浆样品中可同时测到苦杏仁苷及其代谢产物野黑樱苷，且随着给药剂量逐级增加，大鼠体内苦杏仁苷及野黑樱苷含量呈增加趋势，苦杏仁剂量与苦杏仁苷、野黑樱苷血药浓度存在正相关性，为研究苦杏仁剂量与苦杏仁中活性成分在体内血药浓度及治疗效应间的量效关系提供数据参考。此外，本方法利用超高效液相色谱－串联四极杆飞行时间质谱仪可快速准确定性待测成分的离子对，排除未知物对待测成分的干扰，使待测成分在低分辨率的超高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪上能够准确测定，可为生物样品中其他待测成分的鉴别和定量提供参考。

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