一种快速筛查和确定保健品中11种降糖类药物的检测方法

李 强，夏 静，吴春敏，张 岩

（河北省食品检验研究院，河北 石家庄 050091）

在《保健食品检验与评价技术规范》中，将保健食品的功能划分为27类［1，2］，这其中包括辅助降血糖功能。货真价实的保健品确实有辅助治疗的效果，但是，一些不法商贩利欲熏心，不择手段，向保健品中非法添加化学药品，尤其面对老年人常见疾病高血压、糖尿病的保健品，打着纯天然保健的旗号，偷偷在保健食品中非法添加盐酸二甲双胍、盐酸苯乙双胍、盐酸吡格列酮、格列苯脲和格列齐特等化学药品［3－8］，此类药物的原料药价格低廉，却被冠以“新药特药”之名，极大的扰乱了保健食品市场并伤害了消费者的健康［9］。

国家食药局对于保健食品中掺加化学药物的情况十分重视，并多次进行了专项打假行动。但我国目前尚未颁布保健品中掺加降糖类化学药物的有效甄别方法，使得一些执法行动缺少技术依据［10，11］。本实验正是针对常见11种常见降糖药进行检测分析研究，并建立一种方法简便、准确率高、灵敏度高的新方法，以期为整顿保健食品的安全有序的市场氛围提供技术保障和支持。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

UPLC－TOF－MS系统（AB SCIEX TripleTOFTM5600）；超声波清洗器；超速冷冻离心机；全自动氮吹浓缩仪。

11种降糖药对照品：二甲双胍（Metformin Hydrochloride）、苯乙双胍（Phenformin）、格列美脲（Glimepiride）、格列本脲（Glibenclamide）、格列吡嗪（Glipizide）、格列齐特（GLICLAZIDE）、吡格列酮（Pioglitazone）、格列喹酮（Gliquidone）、罗格列酮（Rosiglitazone）、瑞格列奈（Repaglinide）、那格列奈（Neteglinide）。均购自中国食品药品检定研究院。

检测样品为8种适用于糖尿病人和高血压病人食用的保健品，购自当地药店。

1.2 标准溶液配制

分别准确称取11种药品的对照品各10mg于10mL容量瓶中用甲醇溶解，配制成1mg／mL的单标储备液，再分别准确吸取1mg／mL的11种单标储备液各1mL于100mL的容量瓶中，用甲醇定容得到10mg／L的混合标准溶液。使用时用流动相将混标溶液稀释成一系列浓度的标准溶液，待测。

1.3 样品前处理

称取1.0g固体试样或移取5mL液体试样于50mL塑料离心管中，固体试样需加3－5mL水进行分散，待分散均匀后加入15mL甲醇，漩涡振荡器中混匀并超声提取15min，以12000r／min离心5min，转移上清液于50mL容量瓶中，离心管中残渣再用15mL甲醇涡旋混匀并超声提取后，以12000r／min离心5min，合并上清液于容量瓶中，加水定容至50mL，取上清液过0.22μm微孔滤膜，滤液待测。如需稀释上机，需采用50%甲醇水溶液进行稀释操作。

1.4 色谱条件

色谱柱为Phenomenex kinetex 2.6μm C18 100A100＊2.1mm；流动相：正模式下为：5mmol／L乙酸铵溶液和0.5%甲酸乙腈；负模式时：5mmol／L乙酸铵溶液和乙腈；梯度洗脱条件见表1，进样量为5μL。

表1 梯度洗脱条件

1.5 质谱条件

电喷雾电离离子源（ESI）；电离方式为正离子扫描：电离电压5500V，雾化气50，辅助加热气60，辅助气温度550℃；检测模式：飞行时间全扫描质谱和二级质谱模式；TOF－MS扫描范围为m／z100～1000，TOF－MS触发二级扫描范围 m／z100～1000，去簇电压（DP）80V，碰撞能量（CE）10eV；扩展碰撞能量（CES）15eV。

在上述条件下获得的二级质谱谱图，建立了11种违禁药物的MS／MS数据库，包括分子式、相对分子质量、CAS编号、化学名等详见表2。

1.6 定性筛查与定量检测

应用软件中的XIC Manager功能处理采集的数据，根据保留时间和质量准确度，同位素分布以及谱库检索进行定性分析；再以提取一级母离子的峰面积进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件和色谱条件的优化

实验中分别在正模式下考察了11种待测物质的质谱响应，考察了乙腈（0.1%甲酸）、乙腈、甲醇（0.1%甲酸）和甲醇作为流动相中有机相对于目标化合物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明，当进行正模式扫描11种目标物质时，流动相为乙腈（0.1%甲酸）时，各种物质仪器响应值明显高出其他三种有机相的流动相，这是由于甲酸提供的质子更有利于正模式下各物质的离子化，对色谱分离用的梯度洗脱程序进行优化，并使其运行时间控制在9min内完成34种化合物的分析工作。

表2 11种降糖药物的信息表

2.2 提取方法的优化

本实验中的11种化合物均在甲醇或乙腈中具有良好的溶解性，遂考察了不同含量的甲醇水溶液和不同含量的乙腈水溶液对于保健品样品中目标物质的提取效果。结果表明，有机相的比例越高，对于目标物的提取越好。再综合比较甲醇和乙腈在质谱中的雾化效果及经济环保性，最终选择了100%甲醇作为提取试剂，样品的前处理较为简便易操作。同时还考察了采用超声提取方式用10?0%甲醇在10、15、20、25、30min不同时间的提取效果。结果显示超声提取20min为最适宜的时间，杂质提取率低，可满足后续试验中的净化需求。

2.3 质谱定性筛查和定量分析

依据本研究中优化的最佳试验条件，将浓度为50μg／kg的混合标准品进入系统，仪器扫描得到的一级母离子提取离子流图（图1），以及二级高分辨质谱图（图2）。通过对一级和二级谱图中主要特征碎片离子以及保留时间等信息提取并建立了筛查谱库。为了验证筛查谱库的准确性，采用空白加标的方式，依据高精度质量数、保留时间、同位素峰分布及特征碎片离子等参数同谱库进行匹配比对。结果显示，该加标样品中11种化合物均具备较高的匹配度。

2.4 方法的线性关系及定量限

配置不同浓度的11种药物的标准溶液，分别以各目标物质的峰面积和质量浓度进行线性回归计算，得到线性方程和相关系数见表3，可见其线性关系良好，以定量离子的3倍信噪比的响应值对应的化合物浓度作为仪器的检出限。吡格列酮、格列齐特、格列吡嗪、格列苯脲、苯乙双胍、格列美脲的线性范围为10～1000μg／L；那格列奈、二甲双胍、瑞格列奈、罗格列酮、格列喹酮的线性范围为2～500μg／L。

图1 11种降糖药物的一级母离子提取流图

续前

图2 11种降糖药物的二级碎片离子谱图

2.5 回收率与精密度

按照本实验条件，选择一阴性样品基质进行3个水平的加标回收实验，每个添加水平平行测定（n）6次，回收率和精密度实验结果如表4所示。3个添加水平的回收率在72.3%～118.1%，相对标准偏差为0.5%～8.1%。可以看出该实验方法具有良好的精密度和准确度。

表3 11种化合物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

表4 实际样品加标回收率和相对偏差

2.6 实际样品分析

应用本方法对实际样品进行测定，共选取了9个样品，其中只有1个样品中检出了二甲双胍，其含量为15.7μg／kg。使用了软件中XIC Manager功能进行谱库的比对，其得分为92.1，具有较高的匹配度，可以用于普通保健品的筛查定性和定量。

3 结论

本实验建立了高效液相色谱－离子阱飞行时间高分辨质谱法对保健品中降糖及降压类药物的快速筛查和确证的方法，样品提取方便快捷，可同时获取一级和二级精确质量数谱图。利用精确质量数、理论同位素比例分布、保留时间构建的数据库进行了定性筛查，以提取的一级母离子进行定量分析，可以实现较短时间的快速分析和测定，对于不完善的保健品市场中添加违禁药物的现象的杜绝起到一定的监管力量，也同时为打击非法添加违禁药物的市场现状起到了约束和预防的作用。

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