宫颈病灶HSV-2感染及其与宫颈癌的关联性

李成德，李玲，欧丽红，雷伟华，成卓梅，邓超桦，李海珠，莫燕芳

(肇庆市第一人民医院检验科，广东肇庆 526020)

宫颈病灶HSV-2感染及其与宫颈癌的关联性

李成德，李玲，欧丽红，雷伟华，成卓梅，邓超桦，李海珠，莫燕芳

(肇庆市第一人民医院检验科，广东肇庆 526020)

目的观察宫颈病灶中单纯疱疹病毒-2(HSV-2)感染状况，探讨宫颈HSV-2感染与宫颈癌的关联性。方法101例宫颈病变患者中宫颈癌患者46例(癌变组)，宫颈良性疾病55例(对照组)，分别对其宫颈病灶组织和宫颈分泌物进行HSV-2 DNA(实时荧光PCR法)和人乳头瘤病毒(HPV)基因分型(快速导流杂交法)检测。结果宫颈病灶HSV-2 DNA阳性率为10.89%；其中癌变组HSV-2的阳性率为17.39%，对照组为5.45%，两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。宫颈病灶HPV总阳性率为67.33%，共检测出13种HPV亚型，以16型最多见(45.45%)；癌变组(97.83%)与对照组(41.82%)间比较差异有统计学意义(χ2=34.087，P＜0.001)。HSV-2与HPV合并阳性率为9.90%，HSV-2感染的癌变组中HPV阳性率达100%，混合感染的亚型主要为HPV16占75%。结论HSV-2多与HPV 16亚型合并感染宫颈癌患者，其在宫颈癌演变过程中的潜在影响不能忽视。

宫颈癌；单纯疱疹病毒- 2；宫颈组织；人乳头瘤病毒

宫颈癌是导致妇科患者死亡的主要恶性肿瘤，也是目前已明确病因的极少数恶性肿瘤之一，许多研究证实HPV感染是宫颈癌的必要因素，但在致癌过程中它并非单独起作用，还需要一些其他因素来协同或推动疾病进程。单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus-2，HSV-2)曾是最早被认为在诱发宫颈癌过程中起重要作用的一种病毒[1]，其与宫颈癌之间的关系一直存在争议[2-7]。笔者分别对101例以病理学诊断为确诊标准的宫颈病变患者的宫颈病灶组织和宫颈分泌物进行HSV-2 DNA实时荧光PCR和快速导流杂交法人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测，探讨HSV-2与HPV、HSV-2与HPV亚型及其与宫颈癌发生、发展之间的关联性，为宫颈癌的预防和治疗提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源收集2011年1月至2012年12月本院妇科临床资料比较完整的部分手术患者101例，所有患者的沙眼衣原体、梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、Epstein Barr病毒和人巨细胞病毒病源体核酸检测均为阴性。其中癌变组宫颈癌患者46例，年龄32～65岁，平均(42.4±14.6)岁，临床分期参照2010年国际妇女产科协会FIGO分期系统分期：0～Ⅰ期16例，Ⅱ期13例，Ⅲ期12例，Ⅳ期5例；按病理分化程度：低分化癌6例，中分化癌18例，高分化癌22例。宫颈良性疾病(子宫肌瘤5例、宫颈炎15例、CIN 1级12例，CIN 2级16例和CIN 3级7例)55例作为对照组，年龄28～61岁，平均(43.1±15.2)岁，两组间年龄差异无统计学意义。

1.2 标本采集采集患者宫颈病灶新鲜组织和宫颈分泌物标本，宫颈病灶组织即由妇科医生经活检或手术切除术留取子宫颈癌灶新鲜组织，用无菌剪将组织剪成薄片约0.2 cm大小3～5片，放入由凯普生物有限公司提供的有保存液的专用标本管中；宫颈分泌物标本取样步骤和要求：先用棉拭子将阴道或宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，再用宫颈刷紧贴宫颈口稍用力顺时针旋转2～3圈，然后放入同样的专用标本管中；以上标本均于-20℃保存，1个月内测定。

1.3 仪器和试剂基因扩增仪为美国MJ OPTICON-2实时PCR扩增仪、HSV-2 DNA荧光定量PCR检测试剂购自中山大学达安基因股份有限公司。医用核酸分子快速杂交仪HHM-2型及配套HPV核酸扩增和杂交分型试剂盒均由广东凯普生物科技有限公司提供(采用快速导流杂交法检测6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304等21种HPV基因型)。蛋白酶K购自AMRESCO公司。

1.4 实验方法组织标本室温解冻后，用500 μl消化液(50 mmol/LTris，pH 8.5，200 mg/L蛋白酶K)悬浮组织，37℃反应过夜或45℃3 h。其余操作程序同宫颈分泌物标本检测，严格按试剂说明书步骤进行。

1.5 统计学方法采用SPSS15.0统计软件进行统计分析，组间阳性率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈病灶新鲜组织和宫颈分泌物检测的结果HSV-2 DNA阳性率一致，差别仅在两种标本检测阳性扩增曲线出现相差0.5～2个CT值；HPV分型检测结果完全一致。

2.2 宫颈病灶HSV-2的感染状况HSV-2 DNA阳性率为10.89%(11/101)；其中癌变组HSV-2的阳性率为17.39%(8/46)；以FIGO分期：0～Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的阳性率分别为6.25%(1/16)、15.38%(2/13)、33.33%(4/12)和20.00%(1/5)；以病理分化程度：低分化癌、中分化癌和高分化癌阳性率分别为16.67%(1/6)、22.22%(4/18)和13.64%(3/22)；对照组阳性率为5.45%，两组间HSV-2阳性率差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 HPV基因分型检测结果宫颈病灶HPV分型检测阳性率为67.33%(69/101)，共检测出13种HPV亚型(6、11、16、18、31、39、52、53、58、59、66、68和CP8304)，以16型最多见达45.45%。癌变组中16型占47.83%(22/46)；其余亚型以52型(15.58%)、58型(12.99%)和18型(7.79%)多见。癌变组HPV分型阳性率为97.83%(45/46)，与对照组的41.82%(23/55)间差异有统计学意义(χ2=34.087，P＜0.001)。两个或两个以上型混合感染为6.93%(7/101)，见表1。

表1 HPV基因分型检测结果及检出型别构成[例(%)]

2.4 宫颈病灶中HSV-2与HPV合并感染状况宫颈病灶HSV-2与HPV合并阳性率为9.90% (10/101)，癌变组与对照组HSV-2与HPV合并阳性率分别为17.78%(8/45)和4.34%(1/23)，组间差异无统计学意义(P＞0.05)；HSV-2感染的癌变组中HPV阳性率为100%(8/8)；与HSV-2混合感染的亚型主要为HPV16，占75%(6/8)，对照组为0。

3 讨论

HSV-2属于疱疹病毒其中一型，原发感染常引起生殖器疱疹，HSV-2具有肿瘤DNA病毒的性能，可刺激感染的宿主细胞DNA和RNA合成，导致细胞的转变而呈现致癌能力。HSV-2 DNA还可以整合多种正常组织的DNA，使正常细胞转化为肿瘤细胞[8]。研究[9]表明HPV感染并非唯一的宫颈癌致病因素。笔者对确诊患者的宫颈病灶组织和宫颈分泌物HSV-2 DNA和HPV基因分型进行了检测，显示HSV-2 DNA和HPV分型结果分别完全一致，提示：(1)宫颈病变患者合格的宫颈分泌物HSV-2检测可预示其宫颈病灶组织中HPV存在状况；(2)宫颈病灶组织中HSV-2、HPV合并存在可能非偶然，有必要引起关注。

20 世纪中期，HSV-2与宫颈癌相关的研究主要采用抗原或抗体技术进行，HSV-2的检出率较高。宋述梅等[8]直接用HSV-2感染移植宫颈，发现宫颈癌发生率达12.76%，他们认为不可忽视HSV-2在宫颈癌发生中的直接作用。还有研究认为HSV-2作为辅因子诱导被HPV感染宫颈上皮细胞DNA损伤或染色体异常[10]，因此HSV-2被认为在诱发宫颈癌过程中起重要作用。PCR技术出现后，相关报道显示宫颈癌患者宫颈分泌物或组织中HSV-2 DNA检出率高低不一[1-2，5-6，11]，因而，HSV-2在宫颈癌发生、发展中的作用争议颇多。本研究中，101例宫颈病灶HSV-2 DNA阳性率10.89%；其中癌变组HSV-2的阳性率为17.39%，以FIGO分期的癌变组Ⅲ期为33.33%，最多见。说明宫颈病变患者HSV-2的感染率不高，若由此把HSV-2视作宫颈癌发展的辅助因子的假设不容易让人接受[12]。

1974年Zur Hausen提出了人乳头状瘤病毒与宫颈癌发病有关的假设，1995年国际癌症研究协会(IARC)专题讨论会认为HPV感染是宫颈癌的主要病因[13]，WHO于1996年宣布HPV是引起宫颈癌变的首要因素。本实验结果显示在宫颈癌中HPV检测阳性率近100%，共检测出13种亚型，其中以16型最多见占47.83%，验证了这一结论。

1982年Zur Hausen还提出HSV-2作为“启动子”与HPV协同致癌学说，认为HSV-2作为“启动子”反覆感染正常宫颈上皮，在“促进子”HPV的协同作用下致细胞恶变。该假设似乎可以解释宫颈癌患者活检组织中缺乏HSV-2 DNA，然而迄今尚未获得足够的实验依据。本研究中宫颈病变标本癌变组HSV-2的阳性率为17.39%，HSV-2与HPV合并阳性率为9.90%，提示宫颈癌患者感染HSV-2非高概率事件，宫颈细胞中HSV-2可以与HPV感染共存，且在宫颈癌组织中检测到两者的DNA。有报道发现单纯疱疹病毒突变是在一个裂解感染周期中的早期事件，表明宫颈细胞甚至可以由被包装有缺陷的病毒基因组发生突变[10]。因此，尽管人群中宫颈癌的发生是低概率事件，宫颈病变患者HSV-2的感染率也不高，HSV-2在宫颈癌演变过程中的潜在影响还是不能忽视。

Matovina等[14]研究表明7.4%的宫颈病变组织中存在HPV16 DNA整合现象，且整合现象只发生在重度宫颈病变组织中，认为整合是宫颈病变进展过程中的一个重要事件，尽管此整合仅是一个随机事件。本组研究结果显示HSV-2感染的癌变组中HPV阳性率为100%，混合感染的HPV亚型主要为16型占75%，提示在宫颈癌患者中，HSV-2多与HPV16型合并感染。但HSV-2在宫颈病变过程中是否起到启动或推动作用，尚需更深入的研究加以验证。

综上所述，HSV-2出现在宫颈病灶中是低概率事件，不是宫颈癌致病的主要因素，但由于该病毒的致病特点，宫颈病灶HSV-2的持续存在极有可能在宫颈癌演变中起到重要作用，因此，临床上不应忽视对HSV-2感染的宫颈病变患者的诊治。

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Herpes simplex virus-2(HSV-2)infection in cervical lesions and the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.

LI Cheng-de,LI Ling,OU Li-hong,LEI Wei-hua,CHENG Zhuo-mei,DENG Chao-hua,LI Hai-zhu,MO Yan-fang.Department of Clinical Laboratory,the First People's Hospital of Zhaoqing, Zhaoqing 526020,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo observe HSV-2 infection status in cervical lesions，and explore the relationship between cervical HSV-2 infection and cervical cancer.MethodsCervical lesions and cervical secretions were collected from 101 patients with cervical lesion,HSV-2 DNA(real time PCR method)and human papilloma virus(HPV) genotype(flow-through hybridization)were detected.ResultsThe positive rate of HSV-2 DNA in cervical lesions was 10.89%,and that in cancer group and control group was 17.39%and 5.45%,respectively,with no significant difference between the two groups.The positive rate of HPV test in cervical lesions was 67.33%,and 13 subtypes of HPV were found in cervical lesions.The positive rate of the most common subtype of type 16 was 45.45%,and that in cancer group and control group was 97.83%and 41.82%,respectively,with the statistically significant difference between the two groups.(χ2=34.087,P＜0.001).The positive rate of HSV-2 merged with HPV was 9.90%.The positive rate of HPV in cancer group of HSV-2 infection was 100%.mixed infections of HPV16 subtype accounted for 75%. ConclusionHSV-2 is more common in co-infected with HPV16 subtype in patients with cervical cancer,and the potential impact of HSV-2 on cervical evolution should not be ignored.

Cervical cancer;Herpes simplex virus-2(HSV-2);Cervical tissue;Human papilloma virus(HPV)

R737.33

A

1003—6350（2014）16—2395—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0934

2014-02-22)

广东省肇庆市科技创新计划项目(编号：2011E181)

李成德。E-mail：lcd11@126.com