LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅱ)

陈峰，李海龙，赖伟勇，谭银丰

(1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南海口 571101；2.海南医学院药学院，海南海口 571101)

LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅱ)

陈峰1，2，李海龙1，2，赖伟勇1，2，谭银丰1，2

(1.海南省药用植物研究与开发重点实验室，海南海口 571101；2.海南医学院药学院，海南海口 571101)

目的研究大鼠灌胃缩泉胶囊后，益智黄酮(杨芽黄素、伊砂黄素、白杨素、山奈素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚)二相结合产物的酶水解。方法雄性Sprague-Dawley大鼠胆管插管手术完毕后经灌胃给予缩泉胶囊(1.64 g/kg)后收集0～4 h胆汁。胆汁样品经β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH为5的乙酸钠缓冲液)处理后，利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS/MS)进行分析。结果益智黄酮的葡萄糖醛酸结合物在酶水解处理后，代谢物的色谱峰消失，释放出黄酮的原形物质形式。虽然脱甲基反应后形成葡萄糖醛酸结合物也被水解，但并未能检测到脱甲基产物。结论β-葡萄糖醛酸水解酶处理可进一步确定益智黄酮在大鼠胆汁中的物质形式，也为定量分析奠定基础。

缩泉胶囊；益智；黄酮；酶水解；液相色谱-质谱联用仪

尿失禁主诉为尿液不自主的流出，是一种常见的、令人苦恼的疾病，给患者的生活质量带来不利影响[1]。尿失禁有多种致病因素，如膀胱功能障碍(过度活动或活动低下)、物理性的梗阻、感染或者药物的副作用(如咖啡因)。某些较为严重的疾病如癌症、糖尿病、中风、帕金森氏疾病、多发性硬皮病等也可引起尿失禁。根据全国六大区的流行病学调查结果推断，中国女性尿失禁患者平均发病率为30.9%，且年龄越大发病率越高。目前，人们对尿失禁的报道、诊断和治疗显著不足，对尿失禁的重视程度远远不够。我国已经进入老龄化社会，老年人口所占比例日趋增加，尿失禁问题将对个人、家庭及社会带来巨大困扰。

尿失禁的药物治疗越来越受到重视，化学药物(如托特罗定、达非那新和奥昔布宁等)在整个药物治疗市场份额中占据主导地位，而缩泉丸及改进制剂缩泉胶囊是为数不多的治疗尿失禁的中药品种。缩泉丸源于宋代的《魏氏家藏方》[2]，由益智仁、乌药和山药三味中药组成，用于治疗多尿、尿频、遗尿，被2010版《中国药典》一部收载[3]。缩泉丸在国内9家企业生产(其中8个为水丸，1个为胶囊)，其中缩泉胶囊在2012年的销售额达到5 000万元。缩泉丸多成分体内过程研究较为薄弱，机体如何处置缩泉丸中的化学物质尚待阐明。我们分析了缩泉丸中主要成分的含量[4]，并对大鼠灌胃缩泉丸后主要成分益智酮甲在大鼠系统中的暴露进行了初步研究[5]。缩泉丸中黄酮类物质的胆汁排泄研究有助于我们了解这些物质的转运过程，作为这项研究的第一部分，本课题组已经测定了大鼠胆汁中的二相结合产物，本文主要探讨这些二相代谢产物的酶水解。

1 材料与方法

1.1 试药β-葡萄糖醛酸水解酶(HP-2型，来自海曼蜗牛，每毫升含有100 000 U的β-葡萄糖醛酸水解酶和7 500 U的硫酸酯酶水解酶)购自Sigma公司。其他同“LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)[6]。

1.2 实验动物、给药及样品采集同“LC-MS/ MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)。

1.3 胆汁样品的酶水解[7]取100 μl胆汁样品，加入200 μl β-葡萄糖醛酸水解酶(1 000 U/ml，pH为5的乙酸钠缓冲液)，再加入50 μl抗坏血酸(5 mg/ml)，轻轻振摇后，在水浴上37°C孵育60 min。孵育结束后，加入1000 μl乙酸乙酯放在漩涡振荡器上震荡5 min，结束后将样品至于离心机中，离心10 min，吸取上清液900 μl，在N2下吹干，加入50 μl甲醇，在漩涡振荡器上震荡5 min，再离心10 min，吸取40 μl样品溶液置于样品瓶的内衬管中，进样量为10 μl。

1.4 LC-MS/MS分析方法色谱条件和质谱条件同“LC-MS/MS法测定大鼠口服缩泉胶囊后胆汁中的代谢物(Ⅰ)。

2 结果

2.1 白杨素二相代谢产物的水解大鼠灌胃缩泉胶囊后，大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后白杨素及其可能的代谢产物见图1。经水解后，大鼠胆汁中处于结合状态的白杨素被释放出来(保留时间为5.94 min)，原来胆汁中的白杨素单葡萄糖醛酸化代谢物(保留时间为4.14 min)和双葡萄醛酸代谢物(保留时间为3.11 min)的色谱峰消失。

图1 大鼠胆汁中白杨素二相代谢产物的水解

2.2 杨芽黄素二相代谢产物的水解大鼠灌胃缩泉胶囊后，大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后杨芽黄素及其可能的代谢产物见图2。胆汁中杨芽黄素的单葡萄糖醛酸化代谢物(保留时间为4.84 min)的色谱峰消失，释放出杨芽黄素的原形产物(保留时间为7.06 min)。保留时间为5.23 min的色谱峰结构需要进一步的研究。

图2 大鼠胆汁中杨芽黄素二相代谢产物的水解

2.3 伊砂黄素二相代谢产物的水解大鼠灌胃缩泉胶囊后，大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后伊砂黄素及其可能的代谢产物见图3和图4。胆汁样品经甲醇沉淀后未出现伊砂黄素原形物质形式，但酶水解后伊砂黄素从结合物中被释放出来(保留时间为7.30 min)。保留时间为4.28 min的伊砂黄素单葡萄糖醛酸化代谢物以及保留时间为3.79 min双葡萄醛酸代谢物的色谱峰消失，但5.29 min的色谱峰在酶水解时未完全消失。由图4可知，保留时间为4.62 min和4.84 min的单葡萄糖醛酸结合物以及保留时间为3.16 min双葡萄糖醛酸结合产物的色谱峰在酶水解处理后均消失，但并未检测到伊砂黄素的脱甲基化产物。

图3 大鼠胆汁中伊砂黄素二相代谢产物的水解

图4 大鼠胆汁中伊砂黄素脱甲基后的二相代谢产物的水解

2.4 芹菜素-4'，7-二甲氧醚二相代谢产物的水解大鼠灌胃缩泉胶囊后，大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后芹菜素-4'，7-二甲氧醚及其可能的代谢产物见图5。经酶水解后，胆汁中的硫酸酯化的代谢物(保留时间为3.29 min)和芹菜素-4'，7-二甲氧醚的单葡萄糖醛酸化代谢物(保留时间为5.11 min)均消失，此时的胆汁样品可以检测到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的原形物质形式(保留时间为7.22 min)。由图6可知，在胆汁样品中未发现芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脱甲基化产物，芹菜素-4'，7-二甲氧醚脱甲基后所形成的二相结合产物，包括单葡萄糖醛酸结合物(保留时间为4.28 min)和双葡萄糖醛酸结合产物(保留时间为3.25 min和3.79 min)在酶水解处理后均消失。保留时间为5.29 min单葡萄糖醛酸结合物在该样品中依然可以检测到。但是，水解后的样品中未检测到芹菜素-4'，7-二甲氧醚的脱甲基化产物。

图6 大鼠胆汁中芹菜素-4’,7-二甲氧醚脱甲基后二相代谢产物的水解

2.5 山奈素二相代谢产物的水解大鼠灌胃缩泉胶囊后，大鼠胆汁样品经β-葡萄醛酸水解酶水解后山奈素及其可能的代谢产物见图7。胆汁样品经酶水解处理后，山奈素的单葡萄糖醛酸化代谢物(保留时间为4.80 min)和双葡萄醛酸代谢物(保留时间为3.16 min)的色谱峰均消失，在胆汁中发现山奈素的原形物质形式(保留时间为6.15 min)，但浓度较低。保留时间为6.05 min的色谱峰结构需要进一步的研究。

图7 大鼠胆汁中山奈素二相代谢产物的水解

3 讨论

二相代谢产物(如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯结合物等)的水解可采用酸水解或酶水解的方法进行。酸水解时，将样品和酸溶液在一定的温度下反应一定时间，导致酯键断裂。酸水解受酸的种类、浓度、水解温度和水解时间的影响。酶水解相对比较温和，但比较高效，实验费用也比较高。酶的来源、酶浓度、水解温度和时间的也影响水解效果[8]。总的来说，药物二相代谢产物的水解首选酶水解的方法。因此本文采用酶水解的方法，研究益智黄酮二相代谢产物的水解。

白杨素、杨芽黄素、伊砂黄素、芹菜素-4'，7-二甲氧醚和山奈素的葡萄糖醛酸结合物在酶水解后释放出相应的苷元。因为伊砂黄素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚去单甲基后的单葡萄糖醛酸结合物有不同的结合位置，各有两个色谱峰，水解后其中一个(保留时间为4.28 min)消失，另一色谱峰(保留时间为5.29 min)依然可测。另外，伊砂黄素和芹菜素-4'，7-二甲氧醚脱甲基后形成的二相代谢产物在酶处理后也消失，但相应的脱甲基后的黄酮苷元却检测不到。这些现象值得深入研究。

综上所述，我们通过研究发现胆汁中益智黄酮葡萄糖醛酸结合物被β-葡萄糖醛酸水解酶水解，释放出相应的苷元，进一步确定了益智黄酮在大鼠胆汁中的物质形式，也为这些黄酮苷元的定量分析奠定基础。

[1]Robinson D,Cardozo L.New drug treatments for urinary incontinence[J].Maturitas,2010,65(4):340-347.

[2]孙世发.缩泉丸方来源浅析[J].中医杂志,1994,35(7):439.

[3]国家药典委员会.《中国药典》2010版.一部.中国医药科技出版社,2010:1218.

[4]Chen F,Li HL,Li YH,et al.Quantitative analysis of the major constituents in Chinese medicinal preparation SuoQuan formulae by ultra fast high performance liquid chromatography/quadrupole tandem mass spectrometry[J].Chem Cent J,2013,7(1):131.

[5]Chen F,Li HL,Tan YF,et al.Validated method to measure yakuchinone A in plasma by LC-MS/MS and its application to a pharmacokinetic study in rats[J].Chem Cent J,2014,8(1):2.

[6]Qing ZJ,Yong W,Hui LY,et al.Two new natural products from the fruits of Alpinia oxyphylla with inhibitory effects on nitric oxide production in lipopolysaccharideactivated RAW264.7 macrophage cells[J].Arch Pharm Res,2012,35(12):2143-2146.

[7]Shia CS,Hou YC,Tsai SY,et al.Differences in pharmacokinetics and ex vivo antioxidant activity following intravenous and oral administrations of emodin to rats[J].J Pharm Sci,2010,99(4): 2185-2195.

[8]Wang LX,Yuan WW,Scott R,et al."Hydrolysis of PhaseⅡConjugates for LC-MS Bioanalysis of Total Parent Drugs."[J]Handbook of LC-MS Bioanalysis:Best Practices,Experimental Protocols,and Regulations,2013,1:471-477.

Identification of known chemicals and their metabolites in rat plasma after oral administration of SuoQuan capsules using LC-MS/MS(Ⅱ).

CHEN Feng1,2,LI Hai-long1,2,LAI Wei-yong1,2,TAN Yin-feng1,2.1.Hainan Provincial Key Laboratory of R&D of Tropical Herbs,Haikou 571101,Hainan,CHINA;2.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study enzymatic hydrolysis of the flavonoids'(tectochrysin,izalpinin,chrysin, kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)metabolites in rat bile after oral administration of SuoQuan capsules.MethodsCannulas were surgically inserted into the bile duct of male Sprague-Dawley rats(n=3)under anesthesia(pentobarbital,50 mg/kg,i.p.),and the bile was collected for 4 h after oral administration of Suoquan capsules(1.64 g/kg,suspended in 0.5%w/v sodium carboxymethycellulose).After β-glucuronidase(1000 units/ml in pH 5 acetate buffer)treatment,these phaseⅡmetabolites in rat bile samples were hydrolyzed and their aglycones were analyzed using liquid chromatography/tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)with selected reaction monitoring mode.ResultsAfter β-glucuronidase treatment,the mono-or di-glucuronide metabolites of Yizhi flavonoids(tectochrysin,izalpinin,chrysin,kaempferide and apigenin-4',7-dimethylether)could not be detected.On the contrast, the corresponding aglycones were librated from their conjugated forms.However,the O-demethylation metabolites of izalpinin and apigenin-4',7-dimethylether could not be measured,although their glucuronidated conjugates had been found in the rat bile samples.ConclusionThe enzymatic hydrolysis via β-glucuronidase is helpful for the identification of Yizhi flavonoids'phaseⅡmetabolites.Meanwhile,this paper also lays a partial foundation for quantitative analysis of these aglycones.

Suoquan capsules;Alpinia oxyphylla(Yizhi);Flavonoids;Enzymatic hydrolysis;LC-MS/MS

R-332

A

1003—6350（2014）16—2347—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.16.0918

2014-03-27)

海南省自然科学基金项目(编号：812189，813188)

谭银丰。E-mail：112552819@qq.com