骨形态发生蛋白－7通过TGFβ／smad信号通路抑制高糖诱导下足细胞的转分化

徐建伟，刘丽秋＊，赵小丽

（1.青岛市第八人民医院肾内科，青岛266100；2.青岛大学医学院，青岛266021）

骨形态发生蛋白－7通过TGFβ／smad信号通路抑制高糖诱导下足细胞的转分化

徐建伟1，刘丽秋1＊，赵小丽2

（1.青岛市第八人民医院肾内科，青岛266100；2.青岛大学医学院，青岛266021）

目的 通过观察骨形态发生蛋白－7（BMP－7）对高糖环境培养下足细胞p－smad2／3、nephrin、desmin表达的影响探讨BMP－7抑制足细胞转分化机制。方法 以体外培养的小鼠永生化足细胞为研究对象，将其分为以下4组：正常糖组（NG组，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激组（HG组，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干预组（BMP－7组，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇对照组（MN组，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各组干预时间为48h，应用荧光定量PCR法检测足细胞nephrin、desmin mRNA表达量，Western blot检测足细胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表达量。结果 正常状态下足细胞高表达nephrin，少量表达psmad2／3、desmin；高糖刺激可以上调足细胞p－smad2／3、desmin的表达、下调nephrin的表达（P＜0.05）；BMP－7与高糖共同培养在一定程度上可以抑制高糖引起的足细胞p－smad2／3表达上调，减少desmin表达，恢复nephrin表达（P＜0.05）；NG组与MN组之间比较p－smad2／3、nephrin、desmin表达水平无显著差异（P＞0.05）。结论 BMP－7可能通过调节TGFβ／smad信号通路抑制高糖诱导足细胞转分化。

足细胞；上皮细胞－间充质细胞转分化；骨形态发生蛋白－7；TGFβ／smad信号通路；糖尿病肾病

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1069）

研究已证实高糖能介导肾小管上皮细胞发生上皮－间充质转分化（EMT），促进肾脏纤维化发展。在多种细胞EMT过程中，转化生长因子β（TGF－β）被认为是最重要的诱导因子［1］，研究发现高糖环境可以诱导肾脏内TGF－β活性增强。骨形态发生蛋白－7（BMP－7）是TGF－β的拮抗剂，具有强大的抗纤维化作用，研究发现BMP－7可以阻断TGF－β对肾小管上皮细胞EMT的促进作用，延缓糖尿病肾病（DKD）的发展［2］。本研究通过观察BMP－7对高糖环境培养下足细胞p－smad2／3、nephrin、desmin表达的影响探讨BMP－7抑制足细胞转分化的机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 RPMI－1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国hyclone公司），重组小鼠γ－干扰素、重组人BMP－7（美国Peprotech公司），Trizol试剂（美国invitrogen公司），逆转录试剂盒，Premix ExTaq（日本Takara公司），兔抗p－smad2／3抗体（美国cell signaling technology公司），兔抗nephrin抗体、兔抗desmin抗体、兔抗GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔IgG（中国博奥森公司）。

1.2 足细胞的培养与分组 小鼠永生性足细胞系由美国爱因斯坦大学Peter Mundel教授惠赠。足细胞复苏后于含10%胎牛血清，10U／mlγ－干扰素的RPMI 1640培养液中，在33℃，5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液。后转入不含γ－干扰素的10%胎牛血清1640培养液中，37℃培养10－14天，待细胞分化成熟后使用。将分化成熟的细胞接种于25cm2的培养瓶中，待细胞长至70－80%融合时，于无血清的培养液中饥饿24h使细胞同步化。根据实验目的将足细胞分为4个组：正常糖组（NG，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激组（HG，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干预组（BMP－7，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇对照组（MN，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各组干预时间为48h。

1.3 荧光定量PCR 按照Trizol试剂说明书提取各组细胞总RNA，然后利用260nm的吸光度测定OD值和RNA的浓度，按照RT－PCR试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。逆转录条件：37℃15 min，85℃5s。按照SYBR Premix Ex Taq说明书在Light Cycler Real Time PCR扩增仪上进行SYBR Green I实时定量PCR反应，反应条件为：95℃30s预变性，然后95℃5s，60℃30s重复40个循环（引物序列及产物长度见表1）。每个样品设2个复孔，同时设无模板阴性对照。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，确定产物特异性。以GAPDH为内参基因，以正常糖组为对照组，采用2－△△CT法对nephrin、desmin mRNA表达量进行相对定量，△△Ct＝（Ct目的基因－－Ct管家基因）实验组－（Ct目的基因－Ct管家基因）对照组。

表1 目的基因引物序列及其扩增产物大小

1.4 Western blot 收集各组细胞，提取蛋白于95℃变性5min。取上清，各组蛋白和marker分别上样，10%SDS－聚内烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉封闭后以兔抗psmad2／3、nephrin、desmin、GAPDH多克隆抗体分别4℃孵育过夜（分别按1∶500、1∶200、1：200、1：1000稀释）。洗膜后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶8 000）室温孵育1h，ECL显影，凝胶成像系统分析，Quantity One 4.6.2扫描其光密度值，以psmad2／3、nephrin、desmin条带与内参GAPDH条带的光密度值之比值代表其蛋白的相对含量。

1.5 统计学分析 以上实验均重复3次，数据以均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS17.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMP－7干预对高糖刺激足细胞nephrin、desmin mRNA表达的影响

实时定量PCR结果显示，与NG组相比，HG组足细胞desmin表达明显上调，为NG组的4.03倍，而nephrin表达则明显下调，为NG组的0.37倍（P＜0.05）；BMP－7与高糖共培养可以减少高糖引起的足细胞nephrin、desmin的异常表达，（P＜0.05）；MN组与NG组相比较足细胞nephrin、desmin mRNA表达水平无显著差异（P＞0.05）（表2，图1）。

表2 各处理组足细胞nephrin、desmin mRNA的相对表达（¯x±s，n＝3）

2.2 BMP－7干预对高糖刺激足细胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表达的影响

Western blot结果显示，NG组足细胞低表达p－smad2／3、desmin，高表达nephrin；与NG组相比，HG组足细胞p－smad2／3、desmin蛋白表量达明显增加，nephrin蛋白表达量则明显减少（P＜0.05）；与HG组相比，BMP－7组足细胞nephrin蛋白表达量增加，p－smad2／3、desmin蛋白表达量减少（P＜0.05），但与NG组相比仍有差异（P＜0.05）；NG组与MN组相比，足细胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表达量无显著差异（P＞0.05）（图2－4）。

图1 各处理组足细胞nephrin、desmin mRNA的相对表达（实时定量PCR）

图2 各处理组足细胞p－smad2／3蛋白的相对表达（Western blot）

图3 各处理组足细胞nephrin蛋白的相对表达（Western blot）

图4 各处理组足细胞desmin蛋白的相对表达（Western blot）

3 讨论

近年来有实验研究证实，DKD的发生发展过程中可伴随足细胞表型的改变。柏凤等［3］通过高糖刺激体外培养的足细胞，证实高糖能够诱导足细胞α－SMA和FN表达，并降低CD2AP和WT－l表达，提示高糖可能通过诱导足细胞发生EMT。Yamaguchi等［4］发现在DKD患者尿中丢失的足细胞非凋亡状态，且足细胞表达成纤维细胞特异蛋白－1（FSP－1），表明足细胞发生EMT，从而自GBM脱落。本研究通过体外高糖环境下培养足细胞，观察到高糖刺激下调足细胞nephrin表达，上调desmin表达，进一步证实了高糖可以诱导足细胞发生EMT。

肾脏EMT机制的研究目前多集中于肾小管上皮细胞，其中，TGFβ／smad信号通路是介导肾脏纤维化最重要的信号转到途径［5］。DKD时，肾脏TGFβ1表达增加并激活其下游smad2、smad3，后者磷酸化后结合samd4并转入核内，介导肾小管上皮转分化及肾脏纤维化发展［6］。BMP－7又称骨调素－1（OP－1），属于骨形态发生蛋白亚家族（BMPs）。BMP－7最早被认为是诱导骨生成，随后基因敲除实验证实了其在肾脏发育中的重要作用［7］。近年发现BMP－7是体内一种强有力的抗纤维化因子，多项研究明确证实对慢性肾损伤的不同动物模型给予重组人骨形态发生蛋白－7（rhBMP－7）能够减少肾纤维化，改善肾功能［8］。研究发现BMP－7在系膜细胞和小管上皮细胞中可以通过拮抗TGFβ信号改善肾脏纤维化［9，10］。后来，Wang等［11］通过基因转染的技术研究发现，BMP－7可抑制DKD大鼠足细胞数量的减少及足细胞的nephrin蛋白表达水平的降低，减少肾间质胶原Ⅰ的沉积、纤维连接蛋白（FN）的表达，同时减轻尿蛋白和肾小球纤维化，提示BMP－7可逆转足细胞EMT，在DKD中发挥肾脏保护作用。本研究中BMP－7与高糖共培养足细胞48h可以有效减轻高糖诱导的nephrin表达下调和desmin过表达，提示BMP－7可以抑制高糖诱导的足细胞EMT。本研究还发现，高糖环境中足细胞psmad2／3信号活化，提示存在TGFβ／samd信号通路的激活，而BMP－7与高糖共培养可以抑制psmad2／3表达，在一定程度上拮抗高糖引起的TGFβ／samd信号通路的活化，这可能是BMP－7抑制高糖诱导足细胞EMT的重要机制。需要注意的是，高糖环境下足细胞内还存在着其他信号通路的活化，如Integrin／ILK通路、Wnt／β－catenin通路等，这些通路组成错综复杂的网络系统，并在不同层面相互作用，共同调控EMT过程。

［1］Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial－myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin－induced diabetic mice［J］.AmJ Pathol，2009，175：1380.

［2］Niksic L，Martin PY.［BMP－7（Bone morphogenetic protein－7）：a future treatment for chronic renal failure［J］？Rev Med Suisse，2005，1（8）：568.

［3］柏 凤，俞伟男，闻 萍，等.高糖诱导足细胞发生上皮－间叶细胞转分化［J］.中华肾脏病杂志，2009，25（11）：862.

［4］Yamaguchi Y，Iwano M，Suzuki D，et a1.Epithelial－mesenehymal transition as an explanation for pedocyte depletion in diabeticnephmpathy［J］.Am J KidneyDis，2009，54（4）：653.

［5］Liu Y.Epithelial to mesenchymal transition in renal fibrogenesis：Pathologic signifi－cance，molecular mechanism，and thera－peutic intervention［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15：1.

［6］Claire E Hills，Paul E Squires.TGFβ1－induced Epithelial－to－Mesenchymal Transition and Therapeutic Intervention in DiabeticNephropathy［J］.Am J Nephrol.2010，31（1）：68.

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［8］Morrissey J，Hruska K，Guo G，et al.Bone morphogenetie protein－7improves renal fibrosis and accelerates the return of renal function［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13（Supp1）：SI4.

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［10］Zeisberg M，Hanai J，Sugimoto H，et al.BMP－7counteracts TGF－β1－induced epithelial－to－mesenchymal transition and reverses chronic renal injury［J］.Nat Med 2003，9：964.

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Effect of BMP－7 on podocyte Epithelial－Mesenchymal Transition induced by high glucose via TGFβ／smad signal pathway

XU Jian－wei，LIU Li－qiu，ZHAO Xiao－li.
（The Eighth People’s Hospital of Qingdao，Qingdao 266100，China）

Objective To investigate the effect of BMP－7on p－smad2／3expression and epithelial－mesenchymal transition in mice podocyte induced by high glucose.Methods Cultured mice podocyte cells were randomly divided into four groups：normal glucose group（NG，D－glucose 5.5mmol／L），high glucose group（HG，D－glucose 30mmol／L），BMP－7 group（BMP－7，D－glucose 30mmol／L＋rhBMP－7 400ng／ml），mannitol control group（MN，D－glucose 5.5mmol／L＋mannitol 24.5mmol／L）.Cells of different groups were harvested after treatment of 48hours.The mRNA expressions of nephrin and desmin in podocyte were detected by RT－PCR and the protein expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin were detected by Western blot.Results After treatment with high glucose for 48h，the expressions of psmad2／3and desmin were up－regulated while the expression of nephrin was decreased（P＜0.05）.BMP－7alleviated the changes of expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin in podocyte induced by high glucose significantly（P＜0.05）.There was no significant differences between NG group and MN group（P＞0.05）.Conclusion BMP－7can inhibit EMT in podocyte induced by high glucose possibly via TGFβ／smad signal pathway.

podocyte；epithelial－mesenchymal transition；BMP－7；TGFβ／smad signal pathway；diabetic kidney disease

Q786

A

2013－07－26）

1007－4287（2014）07－1069－04

＊通讯作者