黄芪注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤后JNK3基因表达的影响

李 艳 房 雷 黄 惠 王 岭 孙 丽*

（青岛大学第二附属医院神经科，山东 青岛 266043）

黄芪注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤后JNK3基因表达的影响

李 艳 房 雷 黄 惠 王 岭 孙 丽*

（青岛大学第二附属医院神经科，山东 青岛 266043）

目的 探讨黄芪注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤后细胞凋亡和c-jun氨基末端激酶（JNK3）表达的影响。方法 应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立大鼠大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO/R）模型，经腹腔注射黄芪注射液（3 mL/kg）干预治疗。Longa法评分标准评价大鼠神经行为功能，流式细胞术检测海马区神经元凋亡，Western blot检测JNK3蛋白表达，RT-PCR检测JNK3 mRNA表达。结果 经黄芪注射液治疗后，大鼠海马区神经元JNK3蛋白和JNK3 mRNA表达较对照组显著减低，凋亡细胞数量显著减少，而动物神经行为功能显著改善。结论 黄芪注射液可通过下调神经元JNK3基因表达而抑制细胞凋亡，改善动物的神经行为功能。

脑缺血；再灌注损伤；黄芪注射液；JNK3；凋亡；大鼠

c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路是丝裂原活化蛋白激酶中的重要通路，在细胞凋亡过程中发挥重要的调控作用[1]。哺乳动物细胞编码JNK的基因包括jnkl、jnk2和jnk3，其中jnk3编码产物JNK3仅在脑、心脏、睾丸等组织表达[2]。因此，抑制JNK3基因表达是防治脑缺血损伤的重要措施之一[3]。实验证实，许多中药活性成分具有神经保护作用[4]，卓名等[5]研究表明，黄芪注射液能减少脑缺血/再灌注后脑组织中细胞浸润，减轻炎性反应和脑水肿。叶冬青等[6]研究证实，黄芪注射液可抑制凋亡相关基因JNK3表达，但脑保护作用的机制还不十分清楚[7]。本实验拟进一步观察黄芪注射液对脑缺血/再灌注损伤后神经元凋亡和JNK3表达的影响，探讨其神经保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型和分组

成年雄性Wistar大鼠35只（SPF级，体质量230～250 g），由青岛市药物检验所实验动物中心提供（SCXK20090007）。动物置实验室环境适应7 d，自由饮食。随机选择10只为对照组，其余25只应用线栓法经左侧颈外-颈内动脉插线建立MCAO/R模型[8]，缺血2 h后退出插线实现再灌注。对照组的手术步骤相同，但插线进入颈内动脉10 mm后即刻退出。动物苏醒后出现左侧Horner征，提尾右前肢内收屈曲、爬行时向右侧划圈者为成功模型。将术后2 h死亡的5只动物剔除，成功的20只再随机分为模型组和治疗组各10只。

1.2 治疗方案

黄芪注射液（国药准字Z31020084，成都地奥九泓制药厂）。参照刘莎莎等[9]报道的剂量，治疗组动物在造模成功后2 h，经腹腔注射黄芪注射液3 mL/kg，24 h后再给药1次。对照组和模型组同步给予等量生理盐水。

1.3 评级指标

1.3.1 神经行为功能评分

末次给药24 h后，所有动物（n=10）参照Longa评分标准[10]进行。无神经功能缺损0分；不能完全伸直对侧前爪1分；向右侧转圈2分；向右侧倾倒3分；不能自己行走，意识丧失4分。评分越高表示行为功能损伤越严重。

1.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率

每组随机选取5只动物以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速剥离缺血侧海马区脑组织200 mg，-4 ℃冰浴中研磨成脑组织匀浆，收集细胞悬液，低温保存。以Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技公司），用FACS can Calibuer （BD公司，USA）流式细胞检测，于1 h内分析凋亡百分比，以均数±标准差表示。

1.3.3 Western blot检测JNK3蛋白表达

每组随机选取5只动物以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速剥离缺血侧海马区脑组织200 mg，BCA法测定样品总蛋白含量。取蛋白样品50 µg，应用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，半干法转膜（Bio-Rad，USA）。将膜置于X线片盒曝光4 min，显影40 s，定影2 min，水洗5 min。Bio-Rad 2000型凝胶成像系统扫描光片，Quantity one软件进行吸光度分析。以同一标本3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的吸光度值作为内参照，校正目的蛋白的积分吸光度值（样品吸光度值/GAPDH吸光度值），重复测定3次，以均数±标准差表示。

1.3.4 RT-PCR检测JNK3 mRNA

取上述脑组织100 mg，Trizol（Invitrogen，USA）一步法提取总RNA。紫外分光光度计（Beckman，USA）测定RNA纯度。JNK3 PCR引物（F：5’-CTG ATG CAG TGC ACG ATC TAC -3’，R：5’-AGC GTC GTA CTA GAC GTT GCG AT-3’）和GAPDH内参（F：5’-TAG TCT ACA TGC TGC AGT ACT ACT- 3’，R：5’-CGA CTT GAT GTT AGC GAG ATA TC -3’）由上海基康生物技术公司合成。Takara RNA反转录试剂盒（Stanta Cruz，USA）将RNA反转录成cDNA。循环条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 40 s，30个循环；最后72 ℃延伸3 min。反应产物用2%琼脂糖（Sigma，USA）凝胶电泳检测。以目的基因JNK3与内参GAPDH的吸光度比值为目的基因的相对含量。重复测定3次，以均数±标准差表示。

1.4 统计学分析

实验结果采用SPSS15.0软件分析，实验数据以（means ± SD）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。

2 结 果

2.1 神经行为功能评分

对照组动物Longa法评分0分，模型组动物Longa法评分为（2.23± 0.45），治疗组动物Longa法评分为（1.55±0.35），较模型组显著降低（t=5.06，P＜0.01）。

2.2 神经元凋亡

Annexin V-FITC染法流式细胞术检测显示，模型组大鼠海马神经元凋亡率（656±1.65）较对照组（1.67±0.35）明显增高（t=8.20，P＜0.01）治疗组神经元凋亡率（4.35±1.12）较模型组明显降低（t=3.13，P＜0.01）。

2.3 JNK3蛋白表达

Western blot法显示，对照组JNK3蛋白形成较弱11 kD片段（0.326 ±0.081）；模型组JNK3蛋白表达（0.879±0.214）较对照组显著增强（t=6.84，P＜0.01）；治疗组JNK3蛋白表达（0.562±0.136）较模型组明显降低（t=3.54，P＜0.01），见图1。

图1 Western blot法检测JNK3蛋白表达

RT-PCR显示，对照组JNK3 mRNA（197 bp）表达较弱（0.331± 0.065），模型组JNK3 mRNA表达（0.932±0.204）较对照组显著增强（t=7.94，P＜0.01），治疗组JNK3 mRNA表达（0.667±0.165）较模型组显著减弱（t=2.85，P＜0.01），见图2。

图2 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳检测JNK3 mRNA（左）和GAPDH（右）表达

3 讨 论

脑缺血再灌注可诱导细胞凋亡，其中凋亡相关基因JNK3表达与神经元凋亡关系十分密切[10]。如何阻止这种迟发性神经元死亡挽救缺血半暗带成为目前治疗的主要方向[11]。叶冬青[6]等研究表明，缺氧/复氧可增加JNK3表达而诱发神经元凋亡。脑缺血/再灌注损伤应急刺激能激活JNK3使其迅速转入胞核，再激活活化转录因子c-Jun、Jun D，引起大量与凋亡有关的基因表达，诱导延迟性死亡[12]。黄芪甲苷是中药黄芪中提取皂苷的主要成分，已有效应用于心、脑、血管疾病和其他疾病的治疗，作用与机制仍有待于进一步研究[13]。本实验结果表明，脑缺血后海马区神经元JNK3mRNA及其蛋白表达增强，诱导细胞凋亡，神经元变性，大鼠表现为行为功能障碍。经黄芪注射液敢于治疗后，大鼠海马区神经元JNK3 mRNA及其蛋白表达显著减弱，降低JNK3蛋白的活性，神经元凋亡数量显著减少，从而促进神经细胞功能和动物神经行为功能的修复，这与以往的报道[14]结果基本相符，进一步提示，黄芪注射液可通过抑制JNK3的表达，减少细胞凋亡，从而改善动物的神经行为功能，有望为治疗脑缺血/再灌注损伤提供新的方法和途径。

[1] Davis RJ.Signal transduction by the JNK group of MAP kinases[J].Cell,2000,103(4):221-229.

[2] Bogoyevitch MA,Kobe B.Uses for JNK: the many and varied substrates of the c-Jun N-terminal kinases[J].Microbiol Mol Biol Rev,2006,70(4):1061-1095.

[3] O’Collins VE,Macleod MR.Experimental treatments in acute stroke[J].Ann Neurol,2006,59(3):467-477.

[4] Guo YL,Xu XY.Anti-inflammation effects of picrosideⅡ in cerebral ischemic injury rats[J].Behavioral Brain Function,2010, 6(1):43-53.

[5] 卓名,陈鸿莲,蔡娜丽,等.黄芪注射液对新生儿缺氧缺血性脑病的临床与免疫机制研究[J].中国中西医结合急救杂志,2008,15(1):13-15.

[6] 叶冬青,高维娟,钱涛,等.黄芪注射液抑制缺氧缺糖/复氧复糖大鼠海马神经元JNK3的表达[J].中国药理学通报,2010,26(1):77-82.

[7] 曲友直,李敏,高国栋.黄芪注射液对大鼠脑缺血/再灌注后血脑屏障的保护作用及其机制研究[J].中国中西医结合急救杂志,2011,18(5):263-265.

[8] Longa EZ,Weinstein PR.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[9] 刘莎莎,高维娟,钱涛,等.黄芪注射液对脑缺血/再灌注大鼠海马组织JNK-3表达的影响[J].中国药理学通报,2012,28(5):665-670.

[10] Sun W,Gould TW.Phosphorylation of c-Jun in avian and mammalian motoneurons in vivo during apoptosis: An early reversible event in the apoptotic cascade[J].Neuroscience,2005, 25(23):5595-5603.

[11] Kanahal V,Scklichter LC.Mechanisms of microglia-mediated neurotoxicity in a new model of the stroke penumbra[J].J Neuro sci,2008,28(9):2221-2230.

[12] 王宁,薛瑞玲,姚法志,等.JNK3信号转导通路在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用[J].西安交通大学学报,2007,28(6):617-618.

[13] 朱燕辉,严奉祥.黄芪甲苷及其生物学活性[J].现代生物医学进展,2008,8(4):76-87.

[14] 张雅丽,高维娟,闫风霞,等.黄芪注射液抑制缺氧缺糖后复氧复糖大鼠海马神经细胞凋亡的研究[J].中国老年学杂志,2009,29(7):793-796.

The Effect of Astragalus Injection on Apoptosis and Expression of JNK3 in Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats

LI Yan, FANG Lei, HUANG Hui, WANG Ling, SUN Li*
(Department of Neurology, the 2nd Affiliated Hospital, Qingdao University, Qingdao 266043, China)

Objective To study the effect of astragalus injection on neuronal apoptosis and expression of c-Jun N-terminal kinase3 (JNK3) in cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods The middle cerebral artery occlusion reperfusion rat models were established by inserting a filament suture from left external-internal carotid artery, and treated by injecting intraperitoneally astragalus injection (3 mL/kg). The neurobehavioral function was evaluated by Longa’s test and the neuronal apoptosis in hippocampus detected by flow cytometry. The expressions of JNK3 mRNA and protein were respectively detected by western bloting and RT-PCR. Results After treated by astragalus injection, the expression of JNK3 mRNA and protein, the number of apoptotic neurons in hippocampus reduced significantly, while the neurobehavioral function of rats improved than those in model group. Conclusion Astragalus injection might improve the neurobehavioral function of rats by down-regulating the expressions of JNK3 and inhibiting neuronal apoptosis.

Cerebral ischemia; Reperfusion injury; Astragalus injection; JNK3; Apoptosis; Rats

R743.3；R-33

B

1671-8194（2014）18-0001-02

山东省医药卫生科技发展计划项目（2011HW034）

*通讯作者：E-mail： 806451617@qq．com